• Atassia Teleangectasia
• ATM
• autofagia
• CRISPR/Cas9
• KU-55933
• test di locomozione
• Tg(CMV:GFPmap1lc3b)
• Zebrafish

L’Atassia Teleangectasia (AT) è una rara sindrome genetica, caratterizzata da neurodegenerazione cerebellare progressiva, immunodeficienza, ritardo della crescita, predisposizione allo sviluppo di tumori e aumentata sensibilità alle radiazioni. La malattia è causata da mutazioni nel gene ATM, il quale codifica per una serina/treonina proteina chinasi di 350 kDa.
Le conseguenze legate alla perdita di funzione di ATM sulla risposta al danno al DNA nella patogenesi dell’AT sono già state ben caratterizzate, ma le manifestazioni cliniche peculiari della patologia non possono essere attribuite unicamente ad essa.
È noto che la riattivazione dell’autofagia può essere sfruttata come strategia terapeutica per pazienti affetti da patologie neurodegenerative come l’Alzheimer e il Parkinson, ma sono limitate le evidenze relative al coinvolgimento di ATM nel processo autofagico. Studi preliminari condotti su linee cellulari derivate da pazienti affetti da AT hanno dimostrato una ridotta espressione del gene autofagico ATG4C, sia a livello di mRNA sia di proteina. L’espressione di una forma wild type della proteina ATM in queste cellule è in grado di ripristinare i normali livelli di ATG4C, suggerendo il coinvolgimento della proteina, e in generale dell’autofagia, nella patogenesi dell’AT.
L’obiettivo del progetto è quello di studiare il ruolo di ATM come modulatore dell’autofagia nello sviluppo dell’AT sfruttando zebrafish come sistema modello. In zebrafish, il gene atm è presente in singola copia e codifica per due diversi trascritti, atm-201 e atm-202, la cui espressione durante lo sviluppo embrionale in zebrafish è stata valutata mediante Real-time PCR. La proteina Atm di zebrafish mostra elevata omologia con quella umana, specialmente a livello del dominio chinasico.
Per la generazione del mutante con perdita di funzione per atm in zebrafish, è stato microiniettato il sistema CRISPR/Cas9 in embrioni allo stadio zigotico, previa validazione mediante taglio in vitro. L’efficienza di gene editing è stata caratterizzata mediante analisi di Melting e confermata mediante High resolution melting. Gli embrioni mosaico così ottenuti rappresentano la generazione F0 e, al raggiungimento della maturità sessuale, sono stati incrociati con pesci wild type per l’identificazione dei soggetti “fondatori”, ovvero in grado di trasmettere mutazioni nel gene atm alla progenie, grazie all’ottenimento di embrioni eterozigoti per il gene atm +/- (generazione F1). Dopo aver identificato le specifiche mutazioni mediante sequenziamento Sanger, gli eterozigoti verranno incrociati al fine di generare gli omozigoti mutanti atm -/- (generazione F2).
Essendo l’alterazione delle abilità locomotorie uno degli aspetti peculiari dei pazienti affetti da AT, una prima valutazione fenotipica è stata condotta sugli individui della generazione F0, i quali hanno dimostrato un comportamento ipercinetico quando sottoposti al test comportamentale open field.
Inoltre, sono stati eseguiti studi preliminari dell’effetto della somministrazione di KU-55933, inibitore dell’attività chinasica della proteina Atm, su embrioni di zebrafish trattati a partire dallo stadio 6 hpf. Specificatamente, le larve trattate sono state caratterizzate per tasso di sopravvivenza, hatching (fuoriuscita dal corion) e abilità motorie. Infine, per valutare un possibile effetto dell’inibizione dell’attività chinasica di Atm sul processo autofagico, sfruttando l’utilizzo di KU-55933, sono state valutate la fluorescenza della linea transgenica Tg(CMV:GFPmap1lc3b), l’espressione di Lc3 mediante Western Blot e l’espressione di atg4c mediante Real-time PCR.

Ataxia telangiectasia (AT) is a rare childhood autosomal recessive disorder characterized by progressive cerebellar neurodegeneration, immunodeficiency, gonadal atrophy, retarded growth, cancer predisposition and hypersensitivity to ionizing radiation. It is caused by loss of function mutations in the ATM gene, which encodes a 350 kDa serine/threonine protein kinase involved in many cellular pathways. Impairment of ATM-dependent DNA damage response has a well-established role in the pathogenesis of AT. Conversely, the significance of the ability of ATM to act as modulator of autophagy in the development of this disease is still largely obscure.
Preliminary data obtained in a lymphoblastoid cell line derived from a AT patient demonstrated that the expression of Autophagy Related 4C Cysteine Peptidase (ATG4C) is reduced when compared to control cells and the reconstitution of wild type ATM expression in the same line can rescue ATG4C levels.
The aim of the project is to study ATM role as autophagy modulator in the development of AT exploiting zebrafish as a model system.
The atm gene is a single-copy gene in zebrafish and encodes for two different transcriptional isoforms (the longer atm-201 and the shorter atm-202). Protein sequence comparison showed high homology between zebrafish and human ATM protein and in particular a conservation of the kinase domain. Performing Real-time qPCR, we demonstrated that atm is expressed during zebrafish embryonic development and it is characterized by the presence of a maternal component.
Using the CRISPR/Cas9 system, we created loss-of-function mutations in atm gene in zebrafish. We characterized gene editing efficiency by Melting analysis on ribonucleoprotein-injected embryos, further confirmed by High resolution melting. The remaining potential mosaic carrier of F0 generation reached sexual maturation in 5 months and among them we identified 4 founders transmitting atm mutations by outcross with WT fishes to obtain the heterozygous F1 generation. The specific atm mutations obtained have been further characterized by Sanger sequencing.
Moreover, adult individuals of atm F0 underwent open field behavioural test, demonstrating an increased locomotion activity when compared to WT fishes.
In parallel, we started a pharmacological approach for studying the effect of ATM loss of function, based on using KU-55933, that is an inhibitor of ATM kinase activity. In particular, we analysed zebrafish embryos treated at 6 hpf for survival rate, hatching and motility. Finally, autophagy process was monitored in vivo exploiting the Tg(CMV:GFPmap1lc3b) transgenic zebrafish line treated with different doses of KU-55933 and the effect of Atm kinase inhibition on autophagy was evaluated also in terms of Lc3 expression by Western Blot and atg4c expression by Real-time PCR.