ETD

• biomolecular condensates
• liquid-liquid phase separation (LLPS)
• macromolecular crowding
• microfluidics
• phase diagrams
• poly(A) RNA

Liquid-liquid phase separation (LLPS) has emerged as a fundamental mechanism underlying the formation of membrane-less organelles in living cells. Understanding the physicochemical conditions that govern phase separation is critical in drug formulation and RNA-based therapeutics.

In this work, poly(A) RNA was used as a model system to investigate the effect of macromolecular crowders (PEG, Ficoll, and Dextran) on phase separation. Samples were prepared using poly(A), macromolecular crowders, 50 mM Tris-HCl, and 1 M KCl. A systematic dilution series was first used to identify the concentration regime associated with spontaneous poly(A) phase separation. To isolate the effects of macromolecular crowding, subsequent experiments were performed at a subcritical poly(A) concentration of 0.059 g L⁻¹, placing the system in the one-phase region prior to crowder addition.

Building on this baseline, two-dimensional phase diagrams were constructed by manually preparing a sample matrix in which poly(A) and crowder concentrations were varied independently, with each condition assessed by brightfield microscopy. Initial results demonstrate a measurable shift in the phase boundary at PEG 20 kDa concentrations as low as 0.4%, indicating a strong ability to promote condensation. Ficoll 70 kDa induced phase separation at concentrations of approximately 3%, whereas Dextran 500 kDa did not induce phase separation below 5% (m/v). This trend suggests that crowding efficiency depends not only on polymer size but also on crowder architecture and effective excluded-volume interactions, with PEG exhibiting the strongest phase-separation-promoting effect under the conditions investigated.

These results will be compared with data obtained using an in-house combinatorial microfluidic platform, PhaseScan, enabling higher-resolution mapping of the phase boundary. By establishing a quantitative phase-diagram framework using a well-characterised RNA model system, this work provides a foundation for extending crowding studies to more complex biomolecular systems, including proteins and custom peptides, with relevance to biopharmaceutical development and to understanding the physicochemical conditions that drive LLPS and their connection to disease.

La separazione di fase liquido-liquido (LLPS) è emersa come un meccanismo fondamentale alla base della formazione di organelli privi di membrana e condensati biomolecolari nelle cellule viventi. Comprendere le condizioni fisicochimiche che governano la separazione di fase è di fondamentale importanza nel contesto della formulazione di farmaci e delle terapie basate su RNA.

In questo lavoro, l'RNA poly(A) è stato utilizzato come sistema modello per studiare l'effetto di agenti affollanti macromolecolari (PEG, Ficoll e Dextran) sulla separazione di fase. I campioni sono stati preparati utilizzando poly(A), agenti affollanti macromolecolari, Tris-HCl 50 mM e KCl 1 M. Una serie sistematica di diluizioni è stata inizialmente impiegata per identificare l'intervallo di concentrazioni associato alla separazione di fase spontanea del poly(A). Per isolare gli effetti dell'affollamento macromolecolare, gli esperimenti successivi sono stati condotti a una concentrazione subcritica di poly(A) pari a 0,059 g L⁻¹, collocando il sistema nella regione monofasica prima dell'aggiunta degli agenti affollanti.

Partendo da questa condizione di riferimento, sono stati costruiti diagrammi di fase bidimensionali mediante la preparazione manuale di una matrice di campioni nella quale le concentrazioni di poly(A) e degli agenti affollanti sono state variate indipendentemente, valutando ciascuna condizione mediante microscopia in campo chiaro. I risultati preliminari mostrano uno spostamento misurabile del confine di fase per concentrazioni di PEG 20 kDa fino a 0,4%, indicando una marcata capacità di promuovere la condensazione. Il Ficoll 70 kDa ha indotto la separazione di fase a concentrazioni di circa il 3%, mentre il Dextran 500 kDa non ha indotto la separazione di fase a concentrazioni inferiori al 5% (m/v). Questa tendenza suggerisce che l'efficienza dell'affollamento dipenda non solo dalla dimensione del polimero, ma anche dall'architettura dell'agente affollante e dalle interazioni di volume escluso effettive, con il PEG che mostra il più marcato effetto di promozione della separazione di fase nelle condizioni investigate.

Questi risultati saranno confrontati con dati ottenuti mediante una piattaforma microfluidica combinatoriale sviluppata internamente, denominata PhaseScan, che consentirà una mappatura della frontiera di fase a più alta risoluzione. Attraverso la costruzione di un quadro quantitativo basato su diagrammi di fase utilizzando un sistema modello di RNA ben caratterizzato, questo lavoro fornisce una base per estendere gli studi sull'affollamento a sistemi biomolecolari più complessi, inclusi proteine e peptidi progettati ad hoc, con rilevanza sia per lo sviluppo biofarmaceutico sia per la comprensione delle condizioni fisicochimiche che guidano la LLPS e della loro connessione con la malattia.