• Estrogeni

Introduzione - Il Sucralfato (a-D-glucopiranodide, b-D fructofuranosil, octachis (ac.sulfidrico) complesso di alluminio) ¨¨ un agente citoprotettivo impiegato nel trattamento delle ulcere gastroduodenali. Il sucralfato agisce sul processo riparativo e nella guarigione delle lesioni, formando una barriera fisica per la mucosa e proteggendo alcuni fattori di crescita (Epidermal Growth Factor, basic Fibroblastic Growth Factor, Transforming Growth Factor a) dalla degradazione proteolitica in ambiente acido. Nei processi di rimodellamento che accompagnano la guarigione delle ferite ¨¨ essenziale l¡¯espressione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e dei propri ligandi a livello della lesione e del fattore di crescita fibroblastico basico (bFGF), implicato nei processi angiogenetici. Inoltre precedenti dati ottenuti del nostro gruppo mostrano che il Sucralfato ¨¨ in grado di modulare il sistema proteolitico del plasminogeno, in particolare l¡¯espressione del recettore dell¡¯attivatore del plasminogeno tipo-urochinasico (uPAR).
Scopo della ricerca - Nel nostro studio abbiamo valutato l¡¯attivit¨¤ del Sucralfato nei processi di riparazione tissutale in un modello sperimentale di cervicite nel ratto in assenza dell¡¯apporto trofico ormonale. Lo scopo del nostro lavoro ¨¨ stato quello di valutare se nelle ratte ovariectomizzate si osservasse un comportamento analogo a quanto precedentemente rilevato nelle ratte non ovariectomizzate e se la modulazione dell¡¯attivit¨¤ dell¡¯uPAR sia EGFR-mediata. Per rilevare l¡¯attivit¨¤ del farmaco sono stati considerati i seguenti parametri: 1)Interleuchina 6, come marker flogistico; 2) fattore di crescita dei fibroblasti (b-FGF); 3) Recettore per l¡¯attivazione del plasminogeno (uPAR); 4) Recettore per il fattore di crescita epidermico (EGFR).
Materiali e metodi - Sono stati utilizzati 60 ratti femmina Wistar, con un peso di circa gr.200¡À20 che sono stati divisi nei seguenti gruppi sperimentali: 1)Controlli sani; 2)Controlli ovariectomizzati; 3)Ratti ovariectomizzati con lesione cervicale, sacrificati al 4¡ã e 7¡ãgg; 4)Ratti ovariectomizzati, con lesione cervicale, trattati con Sucralfato, sacrificati al 4¡ã e 7¡ãgg. Una volta praticata la lesione, gli animali del gruppo trattato con il farmaco sono stati sottoposti ad una applicazione topica giornaliera di Sucralfato (50 ¦Ìl della preparazione in pomata al 12%), somministrato dal giorno successivo alla lesione fino al giorno del sacrificio; La lesione cervicale ¨¨ stata indotta, dopo anestesia con Cloralio Idrato (300 mg/kg p.c.) (Carlo Erba, Milano ¨C Italia), con un tampone imbevuto di Ac. Acetico glaciale (100 ¦Ìl) (Carlo Erba, Milano ¨C Italia) per 30 sec in modo da creare una lesione di tipo ulcerativo nella porzione intravaginale della cervice uterina. L¡¯ovariectomia ¨¨ stata effettuata, dopo anestesia con Cloralio Idrato, tramite un¡¯incisione longitudinale lungo la linea alba, accedendo alla cavit¨¤ addominale. Successivamente all¡¯individuazione delle corna dell¡¯utero, si applica una legatura con filo da sutura assorbibile, a livello delle estremit¨¤ superiori delle corna, recidendo la porzione superiore e asportando le ovaie. Gli animali operati sono tenuti in isolamento ed in terapia antibiotica per i successivi 4gg. La lesione ¨¨ effettuata dopo 21gg dall¡¯operazione.
Sono stati allestiti preparati istologici colorati con ematossilina-eosina per valutare l¡¯aspetto morfologico della lesione e l¡¯effetto del Sucralfato nel processo di riparazione tissutale. Inoltre con l¡¯impiego di metodiche quali l¡¯analisi Western Blot ed immunoistochimica sono state valutate le variazioni dei livelli bFGF e EGFR, utilizzando specifici anticorpi (rabbit polyclonal IgG anti-EGFR, anti-bFGF) (Santa Cruz, California, USA). Per le valutazioni semiquantitative del Western Blot, le immagini sono state acquisite al computer ed analizzate con un apposito software (Kodak 1D 3.6).
La valutazione della concentrazione dell¡¯interleuchina 6 (IL-6) nell¡¯omogenato di cervice, ¨¨ stata effettuata utilizzando specifici kit ELISA (Bender Medsystem).
Risultati ¨C L¡¯analisi istologica e quella microscopica mettono in evidenzia che la lesione prodotta con Ac. Acetico determina un danneggiamento del tessuto cervicale evidente al giorno 4; l¡¯entit¨¤ della lesione risulta apprezzabile anche al giorno 7. Negli animali con cervicite e trattati con Sucralfato si osserva un sensibile miglioramento al giorno 4, ed al giorno 7 il tessuto sembra ormai avviato ad una completa guarigione. L¡¯analisi mediante test ELISA di IL-6 degli omogenati tissutali evidenzia una riduzione della flogosi, con una diminuzione (non significativa) a 4 (804.255¡À215.372 pg/mg di proteine) e 7gg (661.477¡À183.369 pg/mg di proteine) nel gruppo ovariectomizzato trattato con Sucralfato, rispetto al relativo gruppo ovariectomizzato non trattato (401.3099¡À64.199 pg/mg di proteine) e (364.328¡À52.506 pg/mg di proteine).
Dai dati ottenuti con il Western Blot si evidenzia una variazione significativamente maggiore dei livelli di EGFR, nel gruppo con cervicite trattato con Sucralfato al giorno 4, rispetto al controllo operato (2.157¡À0.726 ua vs 1.00¡À0.105 ua p<0.05) e nel gruppo lesionato sacrificato a 7gg rispetto al relativo gruppo trattato con Sucralfato (2.878¡À0.545 ua vs 1.555¡À0.652 ua p<0.05). I livelli di bFGF sono significativamente maggiori nel gruppo ovariectomizzato con cervicite a 4gg rispetto al controllo operato (2.126¡À0.627 ua vs 0.961¡À0.272 ua p<0.05) e nel gruppo ovariectomizzato con cervicite a 7gg rispetto sia al controllo sano (2.627¡À0.797 ua vs 1.283¡À0.318 ua p<0.05), che al controllo ovariectomizzato (2.627¡À0.797 ua vs 0.961¡À0.272 ua p<0.05). Valori di bFGF significativamente maggiori si osservano ulteriormente nel gruppo ovariectomizzato con cervicite trattato con Sucralfato a 4gg rispetto sia al controllo sano (3.054¡À0.726 ua vs 1,283¡À0,318 ua p<0.05) che al controllo con ovariectomia (3.054¡À0.726 ua vs 0.961¡À0.272 ua p<0.05) e nel gruppo ovariectomizzato trattato con Sucralfato a 7gg rispetto al controllo ovariectomizzato (1.956¡À0.872 ua vs 0.961¡À0.272 ua p<0.05).
La valutazione tramite metodiche immunoistochimiche per la valutazione dell¡¯espressione dei recettori EGFR e uPAR ha evidenziato una analoga distribuzione al giorno 4 sia nel gruppo con cervicite (a livello sottoepiteliale) che nel gruppo trattato con Sucralfato (a livello epiteliale)
Conclusioni - Dai risultati sperimentali ottenuti possiamo concludere che nel nostro modello sperimentale di cervicite nel ratto l¡¯applicazione topica di Sucralfato si ¨¨ dimostrata in grado di accelerare il processo di riparazione della lesione; come ipotizzato nel nostro precedente lavoro, tale effetto potrebbe essere imputato all¡¯effetto anti-flogistico del Sucralfato, alla modulazione sia di fattori di crescita (bFGF) che dei recettori EGFR ed uPAR ed al loro possibile cofunzionamento.