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La malattia di Alzheimer (AD) è una patologia neurodegenerativa di eziologia ignota che normalmente colpisce persone di età superiore ai 60 anni. La malattia di Alzheimer è caratterizzata da un progressivo declino delle funzioni cognitive, quali la memoria, il linguaggio, la capacità di giudizio, l’attenzione e le funzioni esecutive come pianificazione ed organizzazione.
La caratteristica neuropatologica più rilevante nei malati di Alzheimer è rappresentata da una massiccia perdita neuronale e sinaptica a livello di vari sistemi di neurotrasmettitori, in particolare viene colpito il sistema colinergico, con ridotta innervazione nelle aree cerebrali coinvolte nei processi della memoria, quali la corteccia cerebrale e l’ ippocampo. Proprio a livello di queste regioni si ritrovano delle formazioni caratteristiche della malattia: placche di beta-amiloide, grovigli intracellulari della proteina tau ed attivazione di cellule gliali.
Fra i fattori epigenetici che potrebbero contribuire alla neurodegenerazione è stato indicato il Nerve Growth Factor (NGF), un fattore essenziale per la sopravvivenza dei neuroni colinergici del proencefalo basale che innervano la corteccia e l’ippocampo.
Tra i diversi modelli transgenici di AD, ne è stato sviluppato uno che prende in considerazione l’importanza di NGF nell’AD. Questo animale transgenico murino AD11 esprime un anticorpo ricombinante che neutralizza la forma matura di NGF promuovendo il segnale intracellulare del suo precursore proNGF. Per questo motivo a partire da due mesi di età nei topi AD11 si osserva una degenerazione colinergica progressiva dovuta alla mancata esposizione dei neuroni colinergici ad NGF, da cui dipendono. Inoltre, i topi AD11 manifestano, a partire da 6 mesi di età, un deterioramento cognitivo associato ad alterazioni simili a quelle osservate nei pazienti affetti da AD, tra le quali deposizione di placche senili e ammassi neurofibrillari in corteccia ed ippocampo.
Nel mio lavoro di tesi mi sono focalizzata su un particolare aspetto della malattia di Alzheimer nei topi AD11: il ruolo del recettore FcR nella neurodegenerazione. I recettori FcR sono proteine espresse sulla superficie di cellule del sistema immunitario ma anche cellule del cervello, quali microglia e astrociti. Questi recettori legano gli anticorpi quando questi sono legati al proprio antigene e scatenano una reazione immunitaria.
E' stato affrontato questo problema chiedendoci se la neurodegenerazione nei topi AD11 dipenda solo dalla neutralizzazione di NGF, oppure se in questo processo possano essere implicati anche i recettori Fc che riconoscono e legano gli anticorpi ricombinanti (una volta riconosciuto l’NGF endogeno) provocando una reazione autoimmune.
Il lavoro della mia tesi si tratta di uno studio preliminare in topi FcR-/-, in cui il gene codificante per i recettori Fc è stato deleto tramite ricombinazione omologa. Sono stati condotti esperimenti al fine di valutare il fenotipo dei topi FcR -/- a 6 mesi di età, utilizzando i topi non trasgenici (WT) ed i topi AD11 come controlli.
Per valutare se la delezione del FcR determina neurodegenerazione a carico dei neuroni colinergici, ho effettuato esperimenti di immunoistochimica in sezioni del proencefalo basale utlizzando come marcatore dei neuroni colinergici un anticorpo diretto contro la colin acetil transferasi (ChAT), l’enzima biosintetico dell’acetilcolina. Mediante analisi di microscopia ottica delle sezioni è stata effettuata la conta del numero dei neuroni colinergici nelle tre linee di topi e dai risultati si è potuto evincere che i topi FcR-/- non mostrano deficit colinergico a livello del setto mediale del prosencefalo basale.
In secondo luogo, per valutare l’effetto del knockout di FcR sulla deposizione di beta amiloide nell’ippocampo, ho effettuato degli esperimenti di immunoistochimica per la proteina β-amiloide e mediante l’utilizzo del microscopio ottico è stata effettuata la conta dei depositi di β amiloide . Da queste analisi si è potuto osservare che nell’ippocampo dei topi FcR-/- si riscontra la presenza di depositi amiloidi.
Al fine di valutare le variazioni della morfologia degli astrociti, ho condotto esperimenti di immunofluorescenza per GFAP (Glial fibrillary acidic protein), grazie alla quale ho potuto ottenere una marcatura degli astrociti che mi ha consentito di effettuare una analisi delle sezioni tramite microscopia confocale e la successiva analisi morfometrica (numero, volume, area, lunghezza, branching points) con il programma IMARIS. In questo caso, nei topi FcR-/-, è stata riscontrata la presenza di astrociti atrofici presenti nel giro dentato dell’ippocampo (paragonabili ai topi AD11).
Infine, per valutare i livelli di espressione e la quantificazione proteica, sono stati condotti esperimenti di western blotting per APP (proteina precursore amiloide), della quale è stato riscontrato un aumento della proteina in topi FcR-/- e per GFAP, per la quale è stata riscontrata una diminuizione della proteina nei topi FcR-/- sia rispetto ai topi non transgenici che ai topi AD11.
In conclusione, i recettori Fc potrebbero avere un ruolo importante nel mantenimento della morfologia astrocitaria e la loro assenza potrebbe provocare un disequilibrio tra la produzione e la clearance di Aβ nell’ippocampo. Inoltre i topi FcR-/- hanno un fenotipo neurodegenerativo simile a quello dei topi anti-NGF. Quindi non sono utilizzabili per dissezionare il contributo dell’espressione dell’anticorpo ricombinante nel cervello alla neurodegenerazione riportata nei topi AD11.