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Studi condotti sulle propriet¨¤ molecolari del virus dell¡¯immunodeficienza felina (FIV) e sulla storia naturale dell¡¯infezione nel suo ospite naturale, il gatto domestico, rappresentano un buon modello per chiarire i meccanismi patogenetici indotti dal virus dell¡¯immunodeficienza umana (HIV) e sviluppare nuovi approcci terapeutici e vaccinali per la cura delle sindromi da immunodeficienza. Recentemente, tra le diverse strategie vaccinali sperimentate, particolarmente promettenti si sono dimostrati i vaccini attenuati costituiti da virus deleti di uno o pi¨´ geni virali non essenziali alla replicazione ma importanti per patogenicit¨¤. In FIV, il gene accessorio ORF-A ¨¨ essenziale per la replicazione del virus nei linfociti. Al contrario, FIV mantiene la capacit¨¤ replicativa nei macrofagi anche dopo delezione di questo gene. Cloni molecolari FIV deleti in ORF-A e inoculati in vivo hanno dimostrato ridotta patogenicit¨¤ in quanto incapaci di infettare i linfociti. Quando sperimentati come vaccini hanno conferito protezione parziale dalla sfida con un ceppo FIV virulento. Allo scopo di migliorarne le propriet¨¤ vaccinali sono state progettate delle modificazioni genomiche per potenziare l¡¯immunogenicit¨¤ dei cloni molecolari deleti in ORF-A.
Scopo della tesi ¨¨ di produrre dei cloni molecolari FIV deleti in ORF-A e contenenti mutazioni nel gene env, codificante per le glicoproteine virali di superficie. Durante la fase replicativa virale le proteine Env dei lentivirus sono esposte sulla superficie della cellula infetta da dove, mediante endocitosi vengono convogliate in vescicole citoplasmatiche e degradate. E¡¯stato ipotizzato quindi che un blocco a livello della endocitosi potrebbe consentire una maggiore espressione di Env sulla superficie delle cellule infette e quindi di aumentare l¡¯immunogenicit¨¤ dei mutanti ORF-A. L¡¯endocitosi avviene grazie alla presenza di una sequenza segnale localizzata nella porzione intracitoplasmatica di Env, conservata tra tutti i lentivirus e contenente, tra gli altri, gli aminoacidi glicina e tirosina. Per verificare questa ipotesi abbiamo utilizzato due cloni molecolari ¦¤00, contenente il gene ORF-A funzionale e ¦¤23, esprimente una proteina ORF-A tronca. Entrambi i cloni ¦¤00 e ¦¤23 sono stati mutati nella sequenza-segnale per l¡¯endocitosi di Env; una mutazione consiste nella delezione dei codoni che codificano per gli aminoacidi glicina e tirosina, l¡¯altra consiste nella loro sostituzione rispettivamente con un¡¯alanina ed una isoleucina. In questo modo abbiamo ottenuto quattro cloni molecolari replicazione-competenti ¦¤00XX (doppia delezione), ¦¤00AI (con alanina ed isoleucina), ¦¤23XX e ¦¤23AI. Su questi cloni e sui ceppi di controllo con env non modificato abbiamo valutato dinamica del processo di endocitosi e localizzazione della glicoproteina Env nelle cellule infette. rispetto ai cloni di controllo
Cloni mutanti in env, che esprimano alti livelli di glicoproteina virale sulla membrana delle cellule infette e sui virioni da esse prodotte, potrebbero rivelarsi degli ottimi candidati a scopo vaccinale.