• carcinoma sieroso ovarico di alto grado
• classico
• microambiente
• SET
• trascrittomica

Abstract
Il carcinoma sieroso ovarico di alto grado (HGSOC) è la neoplasia ginecologica più aggressiva e letale, caratterizzata da una marcata eterogeneità morfologica, clinica e molecolare. Tra le sue varianti istopatologiche, la classica e la SET (Solid-Endometrioid-Transitional) rappresentano i due principali fenotipi, storicamente considerati sotto la stessa entità nosologica ma verosimilmente differenti sul piano biologico. Questo studio si propone di esplorare in profondità tali differenze, con particolare attenzione ai profili trascrittomici e al microambiente tumorale (TME), al fine di valutare l’esistenza di sottotipi molecolari distinti con potenziali implicazioni terapeutiche.

Obiettivo
L’indagine mira a caratterizzare le differenze fenotipiche, immunologiche e molecolari tra le due varianti, ipotizzando che la variante SET presenti un microambiente tumorale immunologicamente attivo, con una firma genica distintiva associata a maggiore immunogenicità e sensibilità a trattamenti immunomodulanti, mentre la variante classica mostri un profilo più mesenchimale, fibrotico e immuno-esclusivo, potenzialmente più resistente alle immunoterapie convenzionali.

Materiali e Metodi
Lo studio ha incluso 20 campioni tumorali FFPE di HGSOC, raccolti tra il 2018 e il 2023 presso l’UOC di Ginecologia Oncologica. I casi sono stati rivalutati da un punto di vista anatomopatologico per l’attribuzione morfologica a una delle due varianti, secondo i criteri WHO 2020. Sono stati selezionati solo tumori a fenotipo chiaramente SET o classico, con esclusione dei casi a morfologia mista.

La profilazione dell’espressione genica è stata condotta tramite la piattaforma nCounter® PanCancer Progression Panel di NanoString Technologies, che consente la valutazione simultanea di 770 geni associati a pathway tumorali, EMT, motilità cellulare, risposta immunitaria e interazioni con il TME. La digitalizzazione dei segnali è avvenuta senza retrotrascrizione né amplificazione, preservando la rappresentatività molecolare del tessuto FFPE.

I dati grezzi sono stati normalizzati con il software nSolver™ Analysis Software, e analizzati con il modulo Advanced Analysis, applicando modelli lineari generalizzati (GLM) con correzione FDR (Benjamini–Yekutieli). Sono stati considerati significativi i geni con p < 0,01 e fold change ≥1,5. L’analisi esplorativa ha incluso PCA e clustering gerarchico. L’annotazione funzionale è stata condotta con R (v4.3.1) e pacchetti Bioconductor.

Risultati

L’analisi statistica ha rivelato una netta separazione molecolare tra le due varianti, già evidente tramite Principal Component Analysis e clustering non supervisionato. La variante SET e la classica mostrano firme trascrittomiche distintive, coerenti con le osservazioni morfologiche e con la composizione del microambiente tumorale.

Sono stati identificati 58 geni significativamente deregolati, di cui 19 up-regolati nella variante SET e 39 nella variante classica.

Nella variante SET, tra i geni sovraespressi si segnalano:

PTTG1: regolatore del ciclo cellulare, associato a proliferazione elevata e instabilità genomica.

TNFSF10 (TRAIL): ligando pro-apoptotico attivo selettivamente sulle cellule tumorali.

ERBB3 (HER3): recettore tirosin-chinasico coinvolto nella via PI3K/AKT, potenziale target terapeutico.

ESRP1: regolatore dello splicing epiteliale, indicativo di mantenimento fenotipico differenziato.

PLS1 e HRAS: implicati in motilità cellulare e trasduzione del segnale mitogenico.

Il profilo complessivo suggerisce un fenotipo epiteliale-proliferativo con elevata immunogenicità, con potenziale sensibilità a HER3-inibitori, agonisti TRAIL, e immunoterapia combinata.

Nella variante classica, si osserva sovraespressione di geni legati al fenotipo mesenchimale, fibrotico e pro-angiogenico:

TWIST2 e ZEB1: fattori trascrizionali chiave dell’EMT.

DCN e OGN: proteoglicani stromali coinvolti nel rimodellamento della matrice extracellulare.

LTBP4 e FGF2: promotori dell’attività TGF-β e angiogenesi tumorale.

Questi marcatori indicano una maggiore evasione immunitaria, ridotta immunogenicità e una potenziale resistenza ai checkpoint inhibitors, suggerendo il possibile impiego di anti-angiogenici, modulatori del TGF-β e terapie stromali.

Limiti e Prospettive Future

Lo studio, pur fornendo dati promettenti, è limitato dalla dimensione campionaria contenuta e dall’assenza di validazioni proteiche.

Tra le prospettive future si includono:

Analisi proteomiche e funzionali (IHC, Western blot, CRISPRi).

Studi clinici prospettici in coorti più ampie.

Tecnologie a singola cellula (scRNA-seq) e trascrittomica spaziale per mappare il TME.

Conclusione

L’analisi trascrittomica condotta ha evidenziato come le varianti morfologiche classica e SET dell’HGSOC non rappresentino semplici varianti architetturali, bensì entità biologicamente distinte. La SET, con un profilo epiteliale e immunoattivo, si distingue per potenziali bersagli terapeutici (HER3, TRAIL) e sensibilità a trattamenti immunomodulanti. Al contrario, la classica, caratterizzata da firme pro-EMT e stromali, suggerisce l’utilizzo di approcci anti-angiogenici o TGF-β-targeted.

Tali evidenze supportano l’importanza di una classificazione integrata morfologico-molecolare dell’HGSOC, in linea con i principi della medicina di precisione. L’obiettivo a lungo termine è quello di sviluppare algoritmi diagnostici e terapeutici che guidino scelte cliniche personalizzate, riducendo l’eterogeneità terapeutica attuale e migliorando la prognosi delle pazienti.

Abstract
High-grade serous ovarian carcinoma (HGSOC) is the most aggressive and lethal gynecologic malignancy, characterized by marked morphological, clinical, and molecular heterogeneity. Among its histopathological variants, the classic and SET (Solid-Endometrioid-Transitional) subtypes represent the two main phenotypes. Although historically grouped under the same diagnostic entity, they are increasingly recognized as biologically distinct. This study aims to explore in depth the transcriptomic and tumor microenvironment (TME) differences between these two variants, with the goal of assessing the existence of molecular subtypes with potential therapeutic implications.

Objective
The study aims to characterize the phenotypic, immunological, and molecular differences between the two variants. It is hypothesized that the SET variant displays an immunologically active tumor microenvironment, with a distinct gene expression signature associated with greater immunogenicity and potential sensitivity to immunomodulatory treatments, whereas the classic variant exhibits a more mesenchymal, fibrotic, and immune-excluded profile, potentially conferring resistance to conventional immunotherapies.

Materials and Methods
The study included 20 FFPE tumor samples from HGSOC patients, collected between 2018 and 2023 at the UOC of Gynecologic Oncology. All cases were re-evaluated histopathologically to assign morphology according to the 2020 WHO classification. Only tumors with a clearly defined SET or classic phenotype were selected; mixed morphologies were excluded.

Gene expression profiling was conducted using the NanoString® nCounter® PanCancer Progression Panel, which allows the simultaneous quantification of 770 genes involved in tumor progression, EMT, cell motility, immune responses, and TME interactions. Signal detection was performed without reverse transcription or amplification, preserving the molecular integrity of FFPE-derived material.

Raw data were normalized using nSolver™ Analysis Software and analyzed with the Advanced Analysis module, applying generalized linear models (GLMs) and FDR correction (Benjamini–Yekutieli method). Genes were considered significantly differentially expressed if p < 0.01 and fold change ≥ 1.5. Exploratory analyses included Principal Component Analysis (PCA) and hierarchical clustering. Functional annotation was performed using R (v4.3.1) and Bioconductor packages.

Results
Statistical analysis revealed a clear molecular separation between the two variants, as evidenced by PCA and unsupervised clustering. The SET and classic variants showed distinct transcriptomic signatures, consistent with morphological features and the composition of the tumor microenvironment.

A total of 58 significantly deregulated genes were identified, with 19 upregulated in the SET variant and 39 in the classic variant.

In the SET variant, overexpressed genes included:

PTTG1: a cell cycle regulator associated with high proliferation and genomic instability.

TNFSF10 (TRAIL): a pro-apoptotic ligand selectively targeting tumor cells.

ERBB3 (HER3): a tyrosine kinase receptor involved in the PI3K/AKT pathway and a potential therapeutic target.

ESRP1: an epithelial-specific splicing regulator, indicative of a differentiated epithelial phenotype.

PLS1 and HRAS: involved in cytoskeletal remodeling and mitogenic signaling, respectively.

This expression profile suggests an epithelial-proliferative and immunogenic phenotype, with potential sensitivity to HER3 inhibitors, TRAIL agonists, and combination immunotherapies.

In contrast, the classic variant showed overexpression of genes associated with a mesenchymal, fibrotic, and pro-angiogenic phenotype, including:

TWIST2 and ZEB1: key transcription factors driving epithelial-to-mesenchymal transition (EMT).

DCN and OGN: stromal proteoglycans involved in extracellular matrix remodeling.

LTBP4 and FGF2: activators of TGF-β signaling and tumor angiogenesis.

These markers indicate an immune-evasive, low-immunogenicity profile with potential resistance to immune checkpoint inhibitors, suggesting a therapeutic benefit from anti-angiogenic agents, TGF-β modulators, or stroma-targeting strategies.

Limitations and Future Directions
While the study provides promising data, it is limited by its small sample size and the lack of protein-level validation.

Future directions include:

Proteomic and functional validation (e.g., IHC, Western blotting, CRISPRi-based assays);

Prospective clinical studies involving larger, well-characterized cohorts;

Application of single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and spatial transcriptomics to finely map the tumor microenvironment.

Conclusion
The transcriptomic analysis demonstrates that the classic and SET morphological variants of HGSOC are biologically distinct entities rather than mere architectural variants. The SET variant, with an epithelial and immune-active profile, is characterized by potentially targetable pathways (e.g., HER3, TRAIL) and likely greater responsiveness to immunomodulatory therapies. In contrast, the classic variant, defined by pro-EMT and stromal gene expression, may benefit more from anti-angiogenic or TGF-β-targeted therapies.

These findings underscore the importance of an integrated morpho-molecular classification of HGSOC, aligned with the principles of precision oncology. The long-term objective is to develop diagnostic and therapeutic algorithms that support personalized clinical decision-making, aiming to reduce current therapeutic heterogeneity and improve patient outcomes.