• adenosina
• fibrosi polmonare
• lipofibroblasti
• miofibroblasti
• switching fenotipico

La fibrosi polmonare è una condizione patologica cronica che accomuna molti tipi di malattie interstiziali polmonari (ILDs); tra queste la fibrosi polmonare idiopatica (IPF) rappresenta una delle forme più gravi con un’aspettativa di vita dai 3 ai 5 anni dal momento della diagnosi. La patogenesi dell’IPF risulta complessa a causa della numerosità di tipi cellulari e pathways di signalling coinvolti; ancora oggi la causa scatenante è sconosciuta. Nonostante ciò, il parenchima polmonare appare ispessito e con cicatrici dovute ad un’eccessiva attivazione dei processi di riparazione tissutalein risposta ad insulti ripetuti a livello alveolare.
Tra le diverse popolazioni cellulari coinvolte nel processo fibrotico (e.g. cellule epiteliali, cellule immunitarie, mesenchimali ed endoteliali), i fibroblasti sono considerati i principali attori. Sebbene essi svolgano un ruolo chiave nei processi di riparazione dopo un danno, una loro eccessiva attivazione può determinare l’insorgenza e la progressione dello stato fibrotico. In questo contesto i fibroblasti vanno incontro ad uno switch fenotipico trasformandosi in mio-fibroblasti, un fenotipo pro-fibrotico, caratterizzato dall’aumento dell’espressione di α-SMA (α-smooth muscle actin), e dalla capacità contrattile e secretoria associato ad un aumento della deposizione della matrice extracellulare. I mio-fibroblasti possono derivare da molteplici fonti cellulari attraverso diversi meccanismi: oltre al differenziamento dei fibroblasti residenti stimolati da segnali pro-fibrotici come il TGF-β (Transforming Growth Factor-β), possono originare dalla transizione epitelio-mesenchimale (EMT), dalla transizione endotelio-mesenchimale (EndoMT), dalla migrazione e differenziazione di fibrociti circolanti di origine midollare e dalla trasformazione di periciti. A livello molecolare, l’attivazione del TGF-β signalling rappresenta uno dei principali driver del differenziamento a mio-fibroblasti. Il suo legame al recettore, innesca la fosforilazione ed attivazione dei fattori di trascrizione SMAD2 e SMAD3 che modulano l’espressione di geni coinvolti nella fibrogenesi. Inoltre, il TGF-β può anche segnalare tramite le vie non canoniche come MAPK (Mitogen-activated protein kinase), ERK (extracellular-signal regulated kinase), JNK (JUN N-terminal kinase), ROCK (RHO-associated kinase) e AKT che cooperano per promuovere il fenotipo miofibroblastico.
Al contrario dei mio-fibroblasti, i lipo-fibroblasti rappresentano una sottopopolazione di fibroblasti con un ruolo risolutivo dello stato fibrotico, perciò, considerati un fenotipo protettivo. Questi sono caratterizzati dalla presenza di goccioline lipidiche citoplasmatiche denominate LipidDroplets (LDs), che fungono da riserva di lipidi neutri in grado di garantire l’omeostasi e svolgere un ruolo protettivo contro lo stress ossidativo. Queste cellule esprimono specifici marker associati al metabolismo lipidico e al differenziamento adipocitario, tra cui ADRP (Adipocyte Differentiation-Related Protein) conosciuta anche come perilipin-2 (PLIN-2).
Mio-fibroblasti e lipo-fibroblasti si trovano in un equilibrio transiente, infatti i mio-fibroblasti possono trans-differenziare a lipo-fibroblasti in seguito ad attivazione del pathway di signalling del PPAR-γ così come questi possono diventare fonte di mio-fibroblasti attivati in caso di alti livelli di TGF-β e attivazione del pathway canonico TGF-β/SMAD.
Lo stato fibrotico può essere influenzato da vari fattori extracellulari come l’adenosina (ADO). Negli ultimi anni, l’adenosina è emersa come un mediatore chiave nella regolazione della risposta fibrotica polmonare. In condizioni fisiologiche, l’adenosina svolge un ruolo protettivo, modulando l’infiammazione e promuovendo la riparazione tissutale. Tuttavia, in condizioni patologiche, la sua concentrazione extracellulare può aumentare significativamente, contribuendo all’attivazione di vie pro-fibrotiche. Nonostante l’influenza dell’adenosina nello stato fibrotico sia stata osservata, ancora oggi quale sia il suo ruolo preciso rimane sconosciuto.
In questo lavoro di tesi, è stata posta l’attenzione sul potenziale ruolo dell’adenosina nella regolazione dello switching fenotipico dei fibroblasti polmonari umani.
Inizialmente è stata investigata l’espressione dei recettori adenosinici (ARA1, ARA2A, ARA2B e ARA3), dei trasportatori dell’adenosina (ENT1 e ENT2), degli enzimi di produzione extra-cellulari (CD39, CD73) e di degradazione intra-cellulare (ADK) nella linea cellulare di fibroblasti umani IMR-90. In particolare, tra i 4 sottotipi recettoriali, i recettori ARA1 e ARA2B risultano essere maggiormente espressi, così come risultano poco espressi i trasportatori, con un elevata espressione di CD73 e ADK.
Per riprodurre in vitro lo switching fenotipico, le cellule sono state trattate con TGF-β per 24h/48h, Rosiglitazone (un attivatore del PPAR-γ) per 24h/48h, o TGF-β 24h e successivamente Rosiglitazone per 24h/48h per ottenere rispettivamente il fenotipo mio-fibroblastico, lipo-fibroblastico e il trans-differenziamento da mio- a lipo-fibroblasti. A questo punto, tramite Real-Time PCR (RT-PCR) e Western Blot è stata analizzata sia l’espressione genica che proteica dei markers dei mio-fibroblasti (α-SMA), e dei lipo-fibroblasti (PLIN-2 e PPAR-γ).
Nelle IMR-90, trattate con TGF-β, è stato evidenziato un aumento dell’espressione di α-SMA confermando il passaggio a mio-fibroblasto; al contrario, il trattamento con Rosiglitazone aumenta l’espressione di PLIN-2 e PPAR-γ. Il trans-differenziamento da mio- a lipo-fibroblasto è stato confermato da una riduzione del marker pro-fibrotico α-SMA accompagnato da un aumento di PLIN-2 e PPAR-γ rispetto al TGF-β da solo.
Una volta caratterizzato il modello in vitro, è stata valutata la variazione di espressione dei recettori dell’adenosina nel trans-differenziamento, riscontrando solo un particolare incremento dell’espressione del’A2B nei mio-fibroblasti. Oltre ai recettori, è stata valutata la modulazione dell’espressione delle proteine implicate nel metabolismo dell’ADO osservando un incremento significativo dei livelli di CD39 e CD73 nei lipo-fibroblasti.
Inoltre, a seguito di somministrazione esogena di adenosina, è stata evidenziata una maggiore espressione di α-SMA accompagnata da una bassa espressione di PLIN-2 nel trans-differenziamento da mio- a lipo-fibroblasti, confermando quanto noto in letteratura, ossia il suo ruolo pro-fibrotico. Sorprendentemente, in assenza di TGF-β, l’adenosina è in grado di supportare il differenziamento a lipo-fibroblasti suggerendo un suo ruolo omeostatico in condizioni non patologiche.
In conclusione, in questo lavoro di tesi è stato messo a punto un modello di switch fenotipico dei fibroblasti che ha permesso di evidenziare l’adenosina come nucleoside purinico in grado di modulare il differenziamento dei fibroblasti verso un fenotipo fibrotico o meno a seconda dei segnali che prevalgono nel microambiente. Questi risultati aprono la strada ad ulteriori studi per capire se l’adenosina agisca solo tramite l’attivazione di specifici sottotipi recettoriali o possa modulare lo switch fenotipico modificando lo stato metabolico intracellulare.