ETD

• multiple myeloma
• mutations
• NRAS
• silencing
• siRNA

Multiple myeloma (MM) is a haematologic malignancy characterized by the abnormal proliferation
of plasma cells in the bone marrow. Despite therapeutic advances over the past 15 years, it is still
considered incurable. Therefore, a deeper understanding of the molecular mechanisms underlying
the disease is essential for identifying new therapeutic targets for MM treatment. NRAS mutations
are considered high-risk factors in MM patients, contributing to disease progression, relapse, and
drug resistance. Among these, NRAS c.181C>A and c.182A>G are the most frequent mutations in
MM. It is known that these mutations are associated with poorer prognosis and drug resistance in
MM patients, but only few studies have explored their molecular role.
The aim of this study was to assess whether these mutations could represent promising therapeutic
targets in MM. To achieve this, we investigated their molecular and biological roles in MM in vitro
models by allele-specific NRAS silencing using small interfering RNAs (siRNAs).
Mutation-specific siRNAs targeting NRAS c.181C>A (Q61K) and c.182A>G (Q61R) were designed and
screened. Among these, siNRAS A4 and siNRAS G2, targeting NRAS c.181C>A (Q61K) and c.182A>G
(Q61R), respectively, were selected as efficient siRNAs. In particular, siNRAS A4 emerged as a
potential candidate for future clinical application due to its high specificity and silencing efficiency.
Silencing of mutant NRAS alleles determines a downregulation of the MAPK pathway, indicated by
decreased ERK phosphorylation, resulting in reduced cell viability, impaired cell cycle progression,
increased caspase 3/7 activity, diminished migration and colony-forming ability in vitro. These effects
were not observed upon wild-type NRAS silencing. Furthermore, our in vitro findings were validated
in vivo using a zebrafish xenograft model, where mutant NRAS inhibition significantly reduced
tumour growth within the yolk sac three days post-injection.
Overall, these results demonstrate that NRAS mutations modulate various biological processes,
mainly via MAPK pathway regulation, confirming NRAS mutations as promising therapeutic targets
in MM treatment. Finally, the high specificity and efficiency of siNRAS A4 in silencing mutant NRAS
c.181C>A (Q61K) and exerting anti-tumoral activities identify this siRNA as a potential RNA
interference tool for the treatment of NRAS-mutated MM.

Il mieloma multiplo (MM) è una neoplasia ematologica caratterizzata dalla proliferazione anomala
di plasmacellule nel midollo osseo. Nonostante i progressi nel trattamento della patologia negli
ultimi 15 anni, la malattia rimane tuttora incurabile. Pertanto, una comprensione più approfondita
dei meccanismi molecolari alla base del MM è fondamentale per l’identificazione di nuovi bersagli
terapeutici.
Le mutazioni del gene NRAS sono considerate fattori di alto rischio nei pazienti affetti da MM, poiché
contribuiscono alla progressione della malattia, alle recidive e alla resistenza ai farmaci. Tra queste,
NRAS c.181C>A e c.182A>G rappresentano le mutazioni più frequenti nel MM. Tuttavia, sebbene
l’associazione fra queste mutazioni e la prognosi sfavorevole e la resistenza ai farmaci sia nota, il loro
ruolo molecolare finora non è stato ancora completamente identificato.
Lo scopo di questo studio è stato valutare se tali mutazioni potessero rappresentare potenziali
bersagli terapeutici nel MM. A tal fine, abbiamo indagato il loro ruolo molecolare e biologico in
modelli in vitro di MM mediante silenziamento allele-specifico dei trascritti di NRAS attraverso small
interfering RNA (siRNA). Sono stati progettati e testati siRNA specifici per le mutazioni NRAS
c.181C>A (Q61K) e c.182A>G (Q61R). Tra questi, sono stati selezionati per la loro efficienza siNRAS
A4 e siNRAS G2, diretti rispettivamente contro NRAS c.181C>A (Q61K) e c.182A>G (Q61R). In
particolare, siNRAS A4 è emerso come potenziale candidato per future applicazioni cliniche, grazie
alla sua elevata specificità ed efficienza di silenziamento.
Il silenziamento di NRAS mutato ha determinato un’inibizione della via delle MAP chinasi (MAPK),
indicata da una riduzione della fosforilazione di ERK, con conseguente diminuzione della vitalità
cellulare, alterata progressione del ciclo cellulare, incremento dell’attività delle caspasi 3/7 e
riduzione della capacità migratoria e clonogenica. Questi effetti non sono stati osservati in seguito al
silenziamento di NRAS wild-type. Inoltre, i risultati in vitro sono stati confermati in vivo mediante
esperimenti di xenotrapianto in larve di zebrafish, in cui l’inibizione di NRAS mutato ha ridotto
significativamente la crescita tumorale nel sacco vitellino, valutata tre giorni dopo l’iniezione.
Complessivamente, questi risultati dimostrano che le mutazioni di NRAS modulano diversi processi
biologici, principalmente attraverso la regolazione della via MAPK, confermando NRAS come un
promettente bersaglio terapeutico nel trattamento del MM. Infine, l’elevata specificità ed efficienza
di siNRAS A4 nell’inibire l’espressione di NRAS mutato, oltre che nell’indurre effetti antitumorali,
identificano questo siRNA come un potenziale strumento di RNA interference per il trattamento del
mieloma multiplo NRAS-mutato.