• complesso MDM2-p53
• p53

Il fattore di trascrizione p53 resta, ad oltre trent’anni dalla sua scoperta, una delle proteine più studiate nella ricerca sul cancro. L’interesse per questa proteina in tale contesto deriva dal fatto che p53 è risultata inattiva nella maggior parte dei tumori. In circa il 50% dei tumori, il gene codificante p53 è mutato e nella restante metà dei tumori sono state documentate alterazioni genetiche a carico di geni codificanti proteine che regolano l’attività di p53. La funzione principale di p53 è quella di organizzare la difesa della cellula contro la trasformazione neoplastica a seguito di stimoli stressogeni di varia natura. Per esempio, a seguito di danno genotossico la funzione oncosoppressore di p53 si attiva con conseguente induzione di arresto del ciclo cellulare e riparazione del danno al DNA. Se il danno risulta troppo esteso e non può essere riparato, p53 stimola la produzione di proteine che inducono morte cellulare, comportando la selezione negativa della cellula potenzialmente trasformata. In assenza di stimoli stressogeni, i livelli intracellulari di p53 vengono mantenuti bassi dalla ubiquitina ligasi, nota come MDM2 (Murine Double Minute 2). Questa proteina si lega a p53, media la sua esportazione dal nucleo al citoplasma e la degradazione via proteosoma. Nei tumori che esprimono p53 con sequenza amminoacidica normale, frequentemente la inattivazione di p53 è determinata dalla sovraespressione di MDM2. Dati recenti della letteratura hanno evidenziato che, in tali tumori, molecole sintetiche che si legano a MDM2, impedendo la formazione del complesso MDM2-p53, sono in grado di aumentare i livelli intracellulari di p53 e attivare la sua funzione oncosoppressore anche in assenza di stimolo genotossico.
Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare l'attività antitumorale in vitro di molecole di nuova sintesi progettate come potenziali inibitori di MDM2. Queste molecole presentano una struttura carbossilica e sono state sintetizzate presso il laboratorio diretto dal Prof. Armando Rossello del Dipartimento di Farmacia, dell'Università di Pisa, basandosi su studi di modeling molecolare che hanno mimato i contatti e gli orientamenti degli amminoacidi implicati nell'interazione MDM2-p53.
Gli esperimenti sono stati condotti su linee cellulari umane di glioblastoma multiforme (GBM), che esprimono p53 con sequenza normale e sovraesprimono MDM2 (linea cellulare U87MG e U343MG) e su una linea cellulare umana di GBM che esprime p53 con sequenza mutata (linea cellulare T98G). Inizialmente è stata valutata la capacità di tali nuove molecole di dissociare il complesso MDM2-p53 ricostruito in vitro mediante l’uso delle proteine MDM2 e p53 ricombinanti umane. Le molecole che sono risultate più efficaci a dissociare il complesso (RM37 e RM58) sono state selezionate per approfondirne l'attività in cellula. In particolare, è stato valutato se tali molecole influenzassero la vitalità/crescita delle cellule tumorali mediante metodi comunemente impiegati. A livello subcellulare, inoltre, è stato investigato se il trattamento delle cellule tumorali con l’inibitore di MDM2 di nuova sintesi inducesse aumento dei livelli della proteina p53 e attivazione della funzione di p53. Il miglior composto che inibiva la vitalità/crescita delle cellule tumorali in maniera dose e tempo dipendente è risultato RM37. I dati al momento disponibili suggeriscono che la riduzione della vitalità/crescita cellulare sia dovuta ad attivazione del programma di morte apoptotico. Nelle cellule tumorali, RM37 aumentava significativamente i livelli di p53 a causa di una minore interazione di p53 con MDM2 e stimolava l'espressione genica di geni target di p53, suggerendo attivazione della funzione di transattivazione genica di p53.