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La contaminazione delle acque profonde è un tema di attualità che coinvolge non solo l’ambiente ma si riflette sulla salute umana e animale proprio nell’ottica One Health. Le acque possono contenere agenti chimici, quali farmaci, antibiotici, metalli pesanti, disinfettanti, fertilizzanti, oppure microbici come virus, batteri e protozoi che possono passare da matrici come i reflui e attraverso infiltrazione contaminare le falde. Il rischio per l’uomo è associato quindi anche all’uso irriguo per cui i contaminanti microbici possono entrare in contatto con un’esposizione diretta ma anche con la via alimentare a seguito della contaminazione delle colture vegetali.
In questo lavoro di tesi sono stati utilizzati l’adenovirus umano (HAdV-5) e il virus dell’epatite E (HEV-3c), due virus umani a trasmissione enterica, con cui si è contaminata artificialmente l’acqua di irrigazione di 18 piantine di pomodoro. Sperimentalmente sono state allestite 2 serre contenenti i vegetali che sono stati sottoposti a irrigazione periodica con acque contaminate da titolo noto dei 2 virus, ed una serra di controllo dove invece l’irrigazione avveniva con acque sterile. Lo scopo del lavoro è stato quello di valutare la persistenza di tali virus dopo settimane di irrigazione, analizzando i campioni di radici, foglie apicali, suolo e acque di percolazione. Questo al fine di ricreare in laboratorio condizioni di utilizzo di acque profonde per l’agricoltura utilizzando concentrazioni il più possibile vicine a quelle rilevate in tali acque nell’ambiente, seguendo i dati forniti da varie pubblicazioni scientifiche.
HAdV in particolare è stato anzitutto coltivato su cellule A549, a cui è seguita la titolazione virale al fine di valutarne il titolo con metodiche molecolare pari a 1.47x107 cg/µL; mentre il virus HEV è stato fornito dall’Istituto Superiore di Sanità con concentrazione precedentemente determinata di 5x103 cg/µL. Dopo l’esperimento di irrigazione tutti i campioni sono stati conservati a -80°C, e poi gli acidi nucleici virali sono stati estratti tramite kit specifici in relazione al target genomico virale: QIAamp DNA Mini Kit e QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) per le acque di percolazione contaminate; DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) e RNeasy Plant Mini Kit per le porzioni vegetali; e Nuclisens System (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) per i controlli, che sono stati irrigati con acqua sterile. Le aliquote di suolo sono state trattate con Beef Extract a pH9 e centrifugate, prima di essere sottoposte ad estrazione con gli stessi kit citati sopra in relazione al tipo di campione di provenienza. Tutti gli estratti sono stati purificati da inibitori organici, tramite OneStep™ PCR Inhibitor Removal Kit Zymo.
Quindi si è proceduto all’analisi tramite RT-qPCR specifica degli estratti, al fine di verificare la presenza dei virus nei diversi campioni. Nel caso dei campioni contaminati con HAdV, le acque di percolazione e i suoli sono risultati positivi, mentre le porzioni vegetali, radici e foglie, sono risultate positive alla presenza del virus nell’66.6% dei casi (8 positivi su 12 campioni, di cui 6 su 8 radici). I campioni vegetali di HEV sono risultati positivi nel 58% dei casi (7 positivi su 12 campioni, di cui 5 su 7 radici), mentre le acque di percolazione sono totalmente positive; i suoli invece sono risultati positivi nell’83.3% dei casi (5 positivi su 6 campioni di suolo). I controlli, sia per quanto riguarda le porzioni vegetali, che le acque di percolazione, che i suoli, sono risultati negativi, come secondo attese.
I risultati sono promettenti, ma ulteriori analisi saranno sicuramente necessarie, al fine di approfondire questo tema ancora troppo poco trattato in letteratura. Ad esempio, contaminando con acqua di irrigazione arricchita con virus vegetali, o valutando la contaminazione fecale delle acque di irrigazione addizionate tramite colifagi somatici.