• CNP
• NPR-B
• obesità
• peptidi natriuretici
• Real time PCR

Introduzione: L’obesità è stata definita da “Centers for disease control” come una massa corporea di dimensioni maggiori rispetto al normale. È una malattia cronica multifattoriale dovuta non solo a cause genetiche, ma anche ambientali e legate allo stile di vita dell'individuo. L'obesità è anche un fattore di rischio indipendente per le malattie cardiovascolari, associato con sindrome metabolica e con incremento di mortalità e morbidità; inoltre è stata anche definita come un fattore di rischio per le malattie croniche renali e le patologie respiratorie. Alcune forme di obesità, tra cui quella addominale, tipica della sindrome metabolica, sono associate ad una lieve infiammazione cronica in cui i macrofagi si accumulano nel tessuto adiposo e producono citochine infiammatorie come TNF-alpha e IL-6. Recentemente ha assunto importanza il ruolo dei peptidi natriuretici (PN) nella regolazione del peso corporeo in quanto i loro livelli plasmatici risultano diminuiti nei pazienti obesi. È stata osservata una diminuzione dei livelli plasmatici dei PN nei soggetti obesi probabilmente attribuibile o ad un aumento del recettore di clearance o ad una diminuita produzione e minor rilascio di questi peptidi da parte dei miociti. Risulta comunque ancora poco chiaro quale sia il ruolo del peptide natriuretico di tipo C (CNP), un altro membro della famiglia dei PN insieme al peptide natriuretico di tipo A (ANP) e di tipo B (BNP). Attualmente è stato identificato nel sistema CNP/cGMP un importante regolatore naturale di adipogenesi, che potrebbe funzionare come fattore autocrino/paracrino, regolando eventi biologici della fase iniziale di questo processo.
Scopo: Poiché il CNP è stato recentemente identificato avere un ruolo importante nella patologia cardiovascolare, ma anche renale e polmonare, scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di studiare il coinvolgimento di questo peptide e del suo recettore specifico NPR-B nelle patologie principalmente coinvolte nell’obesità. In particolare lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare le variazioni di espressione a livello di mRNA del CNP e del suo recettore specifico NPR-B in tessuto cardiaco, renale e polmonare di ratti Zucker di controllo e obesi. Al fine di ottenere una corretta normalizzazione dei dati ottenuti dagli esperimenti di Real-Time PCR, ulteriore obiettivo è stato quello di selezionare un set di geni di riferimento per il tessuto cardiaco, renale e polmonare nel modello animale sperimentale di obesità utilizzato. Per avere una visione più completa del sistema dei PN e del loro legame con i fattori infiammatori sono state inoltre valutate, negli stessi campioni, le variazioni di espressione di BNP, NPR-C, TNF-alpha e IL-6.
Materiali e metodi: Sono stati studiati 20 ratti maschi Zucker di 9-11 settimane di età, suddivisi in due gruppi: ratti obesi (O, n=10, 351 g) e ratti di controllo (CO, n=10, 287 g) (Charles River Laboratories). Gli animali sono stati studiati in condizioni di digiuno (CO, n=5, glicemia= 118 mg/dl; O, n=5, glicemia= 379 mg/dl) e durante induzione di iperglicemia in seguito ad iniezione di un bolo di glucosio (CO, n=5, glicemia=351 mg/dl; O, n=5, glicemia=448 mg/dl). Da ciascun animale è stato prelevato tessuto cardiaco, renale e polmonare, per un totale di 60 campioni.
L'RNA totale è stato estratto dai campioni tessutali con il metodo guanidina tiocianato-fenolo-cloroformio e ne è stata verificata integrità, purezza e concentrazione. L’espressione a livello di mRNA degli effettori è stata valutata attraverso reazioni di Real-Time PCR previo settaggio delle condizioni ottimali di reazione. Al fine di effettuare una corretta normalizzazione dei dati è stato valutato, per ciascun tessuto, un set di 10 geni di riferimento scelti tra i più studiati in letteratura (ACTB, TBP, GAPDH, SDHA, HPRT-1, Pol2ra, RPL13a, TFCR, YWHAG, PPIA).
Le concentrazioni proteiche del CNP sono state misurate attraverso saggio radioimmunometrico specifico.
Risultati:I geni di riferimento più stabili sono risultati essere: SDHA, HPRT-1 e TBP per il tessuto cardiaco, GAPDH, β-ACTINA e TBP per il tessuto renale e HPRT-1, SDHA e YWHAG per il tessuto polmonare.
Nel tessuto cardiaco dei ratti obesi i livelli di mRNA del CNP sono risultati inferiori rispetto a quelli dei ratti CO come confermato anche dalle concentrazioni proteiche ottenute con la determinazione immunometrica (ratti CO: 0,36±0,07 vs. ratti O: 0,26 ± 0,07 pg/mg). Il BNP ha presentato un andamento analogo mentre l’espressione a livello di mRNA del sottotipo recettoriale NPR-B è risultata significativamente più elevata nei ratti O rispetto ai ratti CO. Il tessuto renale ha mostrato livelli di espressione di CNP e NPR-B simili per i ratti CO e per i ratti O, mentre nel polmone è stata osservata una diminuita espressione di CNP con un aumentata espressione di NPR-B nei ratti O rispetto ai ratti CO, anche se in maniera non significativa. Come per il tessuto cardiaco anche nei reni e nei polmoni le concentrazioni proteiche del CNP riflettono l’andamento osservato a livello di mRNA (rene - CO: 0,20±0,025 vs. O: 0,16 ± 0,01 pg/mg; polmone - CO: 0,46±0,027 vs. O: 0,41 ± 0,02 pg/mg).
Quando i due gruppi studiati, CO e O, venivano ulteriormente suddivisi in ratti a digiuno e con iperglicemia acuta, l’andamento di espressione a livello di mRNA osservato per ciascun gene analizzato rimaneva inalterato.
Una lieve tendenza all’aumento dei livelli di espressione del TNF-alpha nei ratti O e’ stata osservata in tutti i tessuti studiati mentre i livelli di IL-6 sono risultati significativamente diminuti esclusivamente nel tessuto cardiaco dei ratti O (p= 0,05 CO vs. O).
Conclusioni: La selezione dei geni di riferimento per la normalizzazione dei dati di Real-Time PCR ci ha permesso di identificare per ciascun tessuto studiato, cardiaco, renale e polmonare, i geni più stabili nell’obesità, dato ad oggi mancante in letteratura. I dati ottenuti da questo lavoro hanno inoltre evidenziato una diminuzione dei livelli di espressione del CNP con una up-regulation del sottotipo recettoriale NPR-B nel tessuto cardiaco di ratti O rispetto ai ratti CO, sottolineando un coinvolgimento maggiore a livello del cuore rispetto agli altri organi e suggerendo che le minori concentrazioni plasmatiche di CNP, osservate nei pazienti obesi, potrebbero essere dovute ad un ridotto rilascio di questi peptidi da parte dei miociti.