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L'obiettivo di questa tesi è lo sviluppo di immunoassay a sandwich per la rilevazione di due biomarcatori del trauma cranico (TBI): Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) e Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1 (UCH-L1), utilizzando un biosensore a onde acustiche di superficie (SAW). Lo studio è stato condotto presso i laboratori di INTA© Systems, situati all'interno del centro di ricerca NEST a Pisa. INTA© è il primo spin-off deep-tech dell’Istituto Nanoscienze del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR-NANO) e della Scuola Normale Superiore (Università di Pisa). L'azienda ha sviluppato il Lab-on-Chip (LoC) basato su tecnologia SAW, che rappresenta il cuore di questo progetto.

Gli esperimenti iniziali sono stati condotti utilizzando un formato di immunoassay semplice, che ha permesso la rilevazione diretta del marcatore, eliminando la necessità di labeling o amplificazione. Questi test rappresentano una dimostrazione dell'applicabilità del sensore SAW alla rilevazione dei biomarcatori TBI e sono stati fondamentali per la caratterizzazione del sistema. Questo importante traguardo è stato raggiunto grazie allo sviluppo di una strategia originale ed efficace di fissaggio basata sull’utilizzo di plasma umano. Questo approccio ha migliorato significativamente la stabilità del complesso anticorpo-analita e ha consentito una rilevazione affidabile sia di GFAP che di UCH-L1 in soluzione tampone, mantenendo il formato semplice di immunoassay. Inoltre, la rilevazione di entrambi i biomarcatori TBI è stata ottenuta anche direttamente in matrice di plasma umano, sempre mantenendo il formato semplice dell’assay. L’uso strategico del plasma umano non solo ha rafforzato le performance del test, ma ha anche rappresentato un passo avanti verso l’obiettivo del progetto INTA©: la rilevazione dei biomarcatori TBI direttamente nel plasma dei pazienti.

Successivamente, è stato progettato un sistema microfluidico ad hoc e integrato con i biosensori SAW. Questo sistema ha garantito una maggiore riproducibilità tra i replicati sperimentali ed è stato progettato per emulare le condizioni operative del dispositivo NanoAnalyzer©. L’approccio Plasma-Fixing è stato con successo adattato alle condizioni microfluidiche, consentendo una rilevazione stabile e riproducibile di entrambi i biomarcatori TBI. È importante sottolineare che anche la rilevazione diretta degli analiti diluiti in plasma umano è stata riprodotta con successo in condizioni microfluidiche, segnando un avanzamento significativo nello sviluppo del dispositivo INTA©.

Un risultato particolarmente rilevante è stata la prima dimostrazione in assoluto della formazione di un immunoassay a sandwich su biosensori SAW integrati in un sistema microfluidico. Questo risultato è stato ottenuto applicando la strategia di fissaggio due volte, dopo la deposizione sia dell’analita sia dell’anticorpo di rilevazione. Questo traguardo rappresenta un progresso importante verso l’integrazione degli immunoassay all’interno di dispositivi SAW Lab-on-Chip (LoC) in ambienti microfluidici, poiché può consentire il miglioramento delle prestazioni del sensore in termini di limite di rilevazione del biomarcatore.

Le metodologie sviluppate in questo studio si prevede saranno presto incorporate nel funzionamento di routine del prototipo NanoAnalyzer©, avvicinando il sistema alla sua applicazione clinica reale.
I futuri sviluppi si concentreranno sull’ottimizzazione delle strategie di fissaggio e sull’esplorazione di nuovi approcci per migliorare l’amplificazione del segnale. Ad esempio, si ipotizza che l’utilizzo di nanoparticelle d’oro (AuNPs) coniugate agli anticorpi di rilevazione determinerà un aumento dell’intensità del segnale, consentendo così l’analisi di concentrazioni dei biomarcatori clinicamente rilevanti.

This thesis focuses on the development of sandwich immunoassays for the detection of two key traumatic brain injury (TBI) biomarkers: Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1 (UCH-L1), using Surface Acoustic Wave (SAW) biosensor technology.This study was carried out at INTA© Systems laboratories, located within the NEST research center in Pisa. INTA is the first deep-tech spin-off of the National Research Council Nanoscience Institute (CNR-NANO) and Scuola Normale Superiore (University of Pisa). The company developed the SAW-based LoC at the heart of this project.

Initial experiments were conducted using a simple immunoassay format that enabled the direct detection of the marker, eliminating the need for labeling or amplification. These tests represent a proof of concept for the applicability of the SAW sensor to TBI marker detection and were crucial for characterizing the system. This important goal was reached thanks to the development of an original and effective fixing strategy based on human blood plasma. This approach significantly enhanced the stability of the antibody-analyte complex and allowed the reliable detection of both GFAP and UCH-L1 in buffered solution using the simple immunoassay format. Moreover, the detection of both TBI biomarkers was also achieved directly in blood plasma matrix, maintaining the simple assay format. The strategic use of human plasma not only strengthened the assay performance but also allowed us to make a step forward to the goal of INTA©’s project: the detection of TBI biomarkers in the patient’s blood plasma.

Afterward, a custom microfluidic setup was designed and integrated with surface acoustic wave (SAW) biosensors. This setup provided a superior reproducibility across experimental replicates and emulated the operating conditions of the NanoAnalyzer© device. The Plasma-Fixing approach was successfully adapted to microfluidic conditions, allowing for stable and reproducible detection of both TBI biomarkers. Notably, the direct detection of the analytes diluted in blood plasma was also successfully replicated under microfluidic conditions, marking a significant step forward in the development of the INTA© device.

A particularly noteworthy result was the first-ever demonstration of the sandwich immunoassay formation on microfluidic-integrated SAW biosensors. This outcome was reached by applying the fixing strategy twice, after both the analyte and the detection antibody deposition. This milestone represents a significant advancement toward the integration of immunoassays within SAW-based LoC in a microfluidic environment, as it can enable the improvement of sensor performance in terms of biomarker detection limit.

The methodologies established in this study are expected to be incorporated soon into the routine operation of the NanoAnalyzer© prototype, moving the system closer to real-world clinical application.
Future developments will focus on refining fixing strategies and exploring new approaches to enhance signal amplification. For instance, the use of gold nanoparticles (AuNPs) conjugated to detection antibodies is expected to significantly enhance the signal strength, thereby enabling the analysis at clinically relevant biomarker concentrations.