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La mappatura completa della connettività del cervello su scala micro e nanometrica, il cosiddetto Connettoma, è una delle più grandi sfide della ricerca scientifica nelle neuroscienze. Conoscere la struttura e la forma dei neuroni è di grande importanza per poterne capire la funzione, con ricadute sia sulla fisiologia che sulla patologia. La ricostruzione tridimensionale dei neuroni e delle loro sottostrutture, come le spine dendritiche, è essenziale per la caratterizzazione del tipo di cellule e, dal punto di vista pato-fisiologico, per il rilevamento di anomalie morfologiche associate a neuropatie.
L’evoluzione e il miglioramento delle tecniche di imaging hanno ampliato significativamente la nostra capacità di indagare le strutture neuronali. La microscopia ottica è indispensabile per studiare le strutture neuronali sia in campioni ex-vivo che in vivo. Nonostante i progressi nell’imaging ottico, l’osservazione in profondità nei tessuti cerebrali resta una sfida a causa della loro eterogeneità e dell’elevato contenuto lipidico, che provoca dispersione della luce e ostacola la penetrazione degli anticorpi. Tecniche di chiarificazione del tessuto, come CLARITY, sono state sviluppate per ridurre le variazioni dell’indice di rifrazione e la dispersione luminosa, permettendo alla luce di penetrare più in profondità nel campione. Tuttavia, nonostante questi metodi e i miglioramenti nella risoluzione ottenibile, la caratterizzazione morfologica dei neuroni in campioni ex-vivo resta complessa, sia per problemi di rapporto segnale-rumore (CNR) sia per l’organizzazione densa dei neuroni.
Alla luce di queste sfide, la mia tesi di dottorato mira a migliorare le prestazioni e la generalizzabilità degli approcci disponibili per le tecniche di segmentazione neuronale da immagini di microscopia ottica su diverse scale spaziali, concentrandosi sulle arborizzazioni dendritiche e sulla rilevazione delle spine. Dopo un’introduzione sulla struttura e funzione neuronale, con un focus sulla morfologia e sull’importanza clinica delle spine dendritiche, il Capitolo 2 esplora le tecniche di imaging avanzate utilizzate per visualizzare queste strutture, tra cui la microscopia confocale, multifotonica e a super-risoluzione, oltre ai metodi di chiarificazione dei tessuti. In questo capitolo si discutono anche le sfide legate alla segmentazione e ricostruzione neuronale, affrontando i limiti dei metodi manuali e i progressi negli approcci automatici e semi-automatici, in particolare nella ricostruzione delle spine dendritiche e nel rilevamento dei loro colli.
Fulcro di questo lavoro è SENPAI (SEgmentation of Neurons using PArtial derivative Information), un approccio automatizzato e multiscala per la segmentazione delle strutture neuronali. Descritto nel Capitolo 3, SENPAI si distingue per la capacità di segmentare immagini acquisite su campioni chiarificati ex-vivo, dove i neuroni crescono nel loro ambiente naturale, risultando altamente informativi per comprendere la funzione e la patologia neuronale.
SENPAI affronta queste sfide sfruttando informazioni topologiche e algoritmi di clustering basati su derivate parziali per isolare i neuroni e i loro componenti, superando anche i problemi legati al basso rapporto segnale-rumore (CNR), tipico delle strutture più piccole come le spine dendritiche. SENPAI opera attraverso un processo in due fasi che coinvolge segmentazione e parcellazione, catturando la complessa morfologia neurale attraverso varie tecniche di microscopia, inclusi l’imaging confocale e la super-risoluzione STED. La validazione sperimentale di SENPAI, eseguita su set di dati confocali e di super-risoluzione, dimostra la sua efficacia nel rilevare l’arborizzazione neuronale densa e le spine dendritiche, superando gli algoritmi esistenti in termini di accuratezza ed efficienza di elaborazione. I risultati suggeriscono che SENPAI abbia un grande potenziale per applicazioni su larga scala nel neuroimaging, offrendo una soluzione robusta per la segmentazione di neuroni e spine, supportando così i progressi nella comprensione della plasticità sinaptica e dei disturbi neurodegenerativi.
Il mio studio approfondisce inoltre l’analisi della morfologia delle spine dendritiche, un indicatore chiave della salute sinaptica e della neuroplasticità, introducendo un avanzato algoritmo per il tracciamento del collo delle spine laddove esso risulti mancante nella segmentazione. Il metodo proposto, descritto nel Capitolo 4, utilizza l’analisi degli autovalori della matrice di Hessian per riconnettere i colli delle spine ai dendriti nei dataset di imaging 3D. Questo approccio multifase, che sfrutta sia la selezione iniziale dei voxel sia una tracciatura iterativa, garantisce una riconnessione precisa delle spine precedentemente disconnesse, fornendo uno strumento robusto per analizzare la morfologia delle spine in immagini ad alta risoluzione. L’inclusione del filtro di Frangi migliora ulteriormente l’accuratezza del tracciamento, rafforzando il potenziale di questo approccio nella ricerca sulle malattie neurodegenerative.
Inoltre, SENPAI e il metodo di tracciamento dei colli delle spine sono stati integrati in una piattaforma, DenSpine Tool, per l’analisi automatica delle spine dendritiche. DenSpine, descritto nel Capitolo 5, introduce uno strumento per la separazione automatica delle spine dendritiche, progettato per semplificare la pipeline di segmentazione e analisi. DenSpine offre ai neuroanatomisti un’interfaccia intuitiva e capacità di elaborazione ad alto rendimento, permettendo il conteggio efficiente delle spine, la classificazione, l’analisi topologica e morfologica. Le valutazioni comparative dimostrano le ottime prestazioni di DenSpine nel catturare la forma e la struttura delle spine rispetto alla segmentazione manuale di riferimento. Questo strumento risponde alla necessità di misurazioni coerenti e oggettive in grandi dataset, consentendo di ottenere nuove intuizioni sulle relazioni tra struttura e funzione neuronale in contesti sia sani che patologici.
Questa ricerca ha avanzato lo stato dell’arte nella segmentazione e nell’analisi morfologica dei neuroni, sviluppando e validando strumenti innovativi capaci di gestire dataset complessi e multiscala di imaging neuronale.

Summary:
Mapping brain connectivity, known as the Connectome, at micro- and nano- scales is a major challenge in neuroscience. Understanding the structure and shape of neurons is crucial for deciphering their function, with implications for both physiology and pathology. Three-dimensional reconstruction of neurons and their substructures, such as dendritic spines, is fundamental for cell-type characterization and for detecting morphological abnormalities associated with neuropathies.
The evolution and improvement of imaging techniques have significantly expanded our ability to investigate neuronal structures. Optical microscopy is essential for studying neuronal structures in both ex vivo and in vivo samples. Despite advances in optical imaging, imaging deep within brain tissue remains difficult due to its heterogeneity and high lipid content, which causes light scattering and hinders antibody penetration. Tissue clearing techniques, such as CLARITY, have been developed to reduce variations in refractive index and light scattering, allowing light to penetrate deeper into the sample. However, despite these clearing methods and advances in resolution, morphological characterization of neurons in ex vivo samples remains challenging due to contrast-to-noise ratio (CNR) issues and the densely packed organization of neurons.
In light of this, my PhD thesis aims to enhance the performance and generalizability of existing approaches for neuron segmentation from optical microscopy images across different spatial scales, focusing on dendritic arborizations and spine detection. After an overview of neuronal structure and function, with a focus on the morphology and clinical significance of dendritic spines, Chapter 2 explores advanced imaging techniques used to visualize these structures, including confocal, multiphoton, and super-resolution microscopy, as well as tissue clearing methods. This chapter also discusses the challenges of neuron segmentation and reconstruction, addressing the limitations of manual methods and the advancements in automatic and semi-automatic approaches, particularly in the reconstruction of dendritic spines and detection of spine necks.
Central to this work is SENPAI (SEgmentation of Neurons using PArtial derivative Information), an automated, multi-scale approach for segmenting neural structures. The SENPAI approach, described in Chapter 3, is notable for its ability to segment images acquired from clarified ex vivo samples where neurons grow in their native environment, making them highly informative for understanding neural function and pathology. However, segmenting neurons from these samples is a complex task that few existing systems can handle effectively. SENPAI addresses these challenges by leveraging topological information and clustering algorithms based on partial derivatives to isolate neurons and their components, even overcoming low CNR issues typical of small structures like dendritic spines in optical microscopy images. SENPAI operates in a two-step process involving segmentation and parcellation, capturing complex neural morphology across various microscopy techniques, including confocal and super-resolution STED imaging. Experimental validation of SENPAI demonstrates its effectiveness in detecting dense neuronal arborization and dendritic spines, surpassing existing algorithms in terms of accuracy and processing efficiency. The results suggest that SENPAI holds strong potential for large-scale neuroimaging applications, providing a robust solution for neuron and spine segmentation and supporting advances in the understanding of synaptic plasticity and neurodegenerative disorders.
This study also addresses the analysis of dendritic spine morphology, a key indicator of synaptic health and neuroplasticity, by introducing an advanced spine neck tracing algorithm to recover necks missing in segmentations. The proposed approach, detailed in Chapter 4, uses Hessian matrix eigenvalue analysis to reconnect spine necks to dendrites in 3D imaging datasets. Based on a multi-phase process leveraging initial voxel selection and iterative tracing, the algorithm ensures accurate reconnection of previously disconnected spines, offering a reliable tool for spine morphology analysis in high-resolution images. A Frangi filter step further improves tracing accuracy by enhancing signal clarity, highlighting the potential of this model-free approach in neurodegenerative disease research.
Additionally, SENPAI and the spine neck tracing method are integrated into a comprehensive software platform, DenSpine Tool, for automated dendritic spine analysis. DenSpine, introduced in Chapter 5, also includes a tool for the automatic separation of dendritic spines. Designed to streamline the segmentation and analysis pipeline, DenSpine offers neuroanatomists a user-friendly interface and high-throughput capabilities, enabling efficient spine counting, classification, and topological and morphological analysis. Comparative evaluations demonstrate DenSpine’s strong performance in capturing spine shape and structure relative to manual segmentation. This tool meets the need for consistent and objective measurements in large datasets, enabling new insights into structure-function relationships in both healthy and diseased neuronal contexts.
This research has advanced the state of the art in neuron segmentation and morphological analysis by developing and validating innovative tools capable of handling complex, multi-scale neural imaging datasets effectively.