• apoptosi
• biomateriali polimerici
• cardiovascolare
• immunocompatibilità
• PEtU-PDMS
• produzione citochinica

RIASSUNTO

Nella valutazione generale della biocompatibilità di un materiale polimerico, lo studio della sua immunocompatibilità è di fondamentale importanza al fine di un suo potenziale utilizzo per scopi clinici. E’ noto, infatti, che i polimeri attualmente impiantati possono indurre una significativa risposta immunologica di tipo innato che si traduce in termini di attività fagocitica che influenza la tolleranza a lungo termine dell’ospite.
In relazione alla problematica sopra esposta, l’obiettivo di questo lavoro di tesi è la comprensione della reattività immunologica di un nuovo materiale elastomerico, denominato PEtU-PDMS, un polimero a base di poli-etere-uretano (PEtU) reticolato con percentuali diverse di silicone (polidimetisilossano, PDMS), fino ad ottenere un rapporto di 1:1 dei due componenti. In particolare, verrà valutato come la superficie del suddetto materiale influenzi, in condizioni statiche, l’apoptosi linfo-monocitaria, l’adesione e la produzione citochinica monocitaria ed, in condizioni dinamiche, l’attivazione piastrinica e leucocitaria.
Il materiale è stato sintetizzato con percentuali crescenti di PDMS (10, 30 e 50), e processato per ottenere campioni sottoforma di struttura piana, per gli studi statici, e sottoforma di protesi vascolare, per gli studi dinamici. Le strutture piane sono state fabbricate mediante due metodologie differenti, casting e spray, le protesi vascolari mediante la procedura spray. Come riferimento sono stati utilizzati materiali, attualmente utilizzati nel settore cardio-vascolare, previsti dalle normative ISO sui dispositivi impiantabili (ISO 10993-12). Tutti i materiali sono stati sterilizzati con la stessa procedura di sonicazione (20’ in HCL 0,4N e per 10’ in acqua sterile).
La morfologia superficiale dei campioni in PEtU-PDMS è stata analizzata mediante osservazione allo stereo-microscopio ed al microscopio elettronico a scansione (SEM). Queste analisi hanno dimostrato che i campioni processati per casting presentano una superficie non porosa e più liscia rispetto a quella tendenzialmente rugosa dei campioni processati mediante spray. La superficie luminale delle protesi vascolari in PEtU-PDMS, al contrario, si è dimostrata essere altamente micro-porosa (pori con diametro medio ~ 100 μm).
L’induzione di apoptosi è stata quantificata mediante citofluorimetria utilizzando il saggio dell’annessina V/Propidio Ioduro su linfo-monociti umani isolati da sangue periferico in seguito ad incubazione di 24 ore con estratti del materiale preparati in accordo alla normativa relativa (ISO 10993-12).
La quantificazione citofluorimetrica del rilascio di citochine pro- e anti-infiammatorie IL-1β, IL-6, TNF-α, e IL-10 è stata condotta mediante saggio delle micro-beads fluorescenti (FBI) sul terreno di coltura della linea cellulare monocitaria THP-1, in seguito a 24 ore di incubazione con i campioni.
La valutazione quantitativa dell’adesione cellulare, in seguito 24 ore di incubazione di cellule THP-1 con i campioni, è stata eseguita mediante conta automatica previa colorazione delle cellule con Giemsa.
Per la valutazione dell’immunocompatibilità in condizioni dinamiche, sangue umano anticoagulato è stato fatto circolare all’interno di protesi vascolari utilizzando un sistema di perfusione in vitro. Al termine di 2 ore di circolazione sui plasmi raccolti è stato eseguito il dosaggio della β-tromboglobulina (β-TG), noto marker di attivazione piastrinica, con un saggio ELISA e delle stesse citochine valutate nello studio statico mediante saggio FBI.
I risultati ottenuti hanno dimostrato che solo i campioni in PEtU-PDMS processati per spray mostrano un effetto pro-apoptotico, dipendente dalla percentuale di PDMS; infatti, solamente quelli con il 50 % inducono un livello di apoptosi significativo, sia rispetto al controllo negativo sia rispetto ai materiali di riferimento. L’adesione monocitaria sembra essere influenzata solamente dalla procedura di fabbricazione, infatti, campioni processati per casting mostrano livelli di adesione paragonabili ai materiali di riferimento mentre quelli per spray rivelano valori di adesione significativamente maggiori. Infine, il contenuto di PDMS risulta influenzare in maniera significativa anche il rilascio citochinico, sia in condizioni statiche che dinamiche, e la trombogenicità in condizioni dinamiche, infatti, i campioni in PEtU-PDMS con un alto contenuto di PDMS (30 e 50 %) hanno indotto una minor attivazione piastrinica, in termini di rilascio di β-TG, e leucocitaria, in particolare di IL-1β e IL-6.
Al contrario, la produzione delle altre citochine quantificate in questo studio, TNF-α e IL-10, non sembra subire l’influenza né della procedura di fabbricazione né della percentuale di PDMS.