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TCF4 è il gene codificante per il fattore di trascrizione 4, le cui mutazioni sono associate alla Sindrome di Pitt-Hopkins, un raro disordine del neurosviluppo. I pazienti affetti da questa patologia mostrano dismorfismo facciale, ritardo dello sviluppo e motorio, disabilità intellettiva e problemi respiratori. La maggior parte delle mutazioni si localizzano nell’esone che codifica per il dominio bHLH, con una conseguente perdita di funzione della proteina.
Nel nostro laboratorio, abbiamo generato una linea mutante di tcf4 con una delezione di 13 nucleotidi nella regione del gene codificante per il dominio bHLH della proteina, con la conseguente formazione di un codone di stop prematuro.
Nel mio progetto di tesi ho svolto una caratterizzazione fenotipica delle generazioni F2 e F3 della linea mutante, focalizzandomi maggiormente sul neurosviluppo e ricercando, attraverso tecniche di immunoistochimica, eventuali differenze tra gli individui eterozigoti mutanti e controlli per poter validare la nostra linea come modello della patologia. Gli embrioni tcf4+/- sono stati fissati a diversi stadi di sviluppo, nello specifico a 3 dpf (days post fertilization), 4 dpf e 5 dpf, e sugli stessi ho testato diversi marcatori. Attraverso queste indagini sono riuscita ad identificare alterazioni a livello dello scheletro craniofacciale, quali una riduzione significativa delle dimensioni delle strutture cartilaginee negli eterozigoti, andando ad osservare fenotipi a stadi larvali più avanzati e più tardivi, cercando di identificare la finestra temporale in cui la perdita di funzione di TCF4 va ad alterare lo sviluppo craniofacciale. I risultati presentati in questa tesi suggeriscono che TCF4 vada ad agire a monte del master regulator della condrogenesi Sox9. Ho anche osservato una riduzione in dimensioni di una specifica area cerebrale, l’abenula, coinvolta nella regolazione di processi comportamentali, soprattutto per quanto riguarda la sfera sociale. Infine, ho svolto indagini a livello intestinale, in quanto uno dei segni clinici ricorrenti nei pazienti affetti da Pitt-Hopkins è una riduzione della peristalsi intestinale, da questi è emersa una riduzione del numero dei neuroni enterici negli individui tcf4+/- rispetto ai controlli tcf4+/+.
La caratterizzazione di questo modello knock-out di TCF4 potrebbe essere di notevole importanza per la ricerca di questa malattia genetica rara. Un modello zebrafish per la Pitt-Hopkins potrebbe portare numerosi vantaggi in quanto potrebbero essere investigati aspetti che nel modello murino, già esistente, sono di difficile, quasi impossibile, approfondimento. Inoltre, il modello malattia in zebrafish sarà disponibile per tutta la comunità scientifica per eventuali test farmacologici ad ampia scala.

TCF4 is the gene encoding transcription factor 4, whose mutations are associated with Pitt-Hopkins syndrome, a rare neurodevelopmental disorder. Patients affected by this condition exhibit facial dysmorphism, developmental and motor delay, intellectual disability, and respiratory problems. Most mutations are located in the exon encoding the bHLH domain, resulting in a loss of protein function.
In our laboratory, we have generated a mutant tcf4 line with a 13-nucleotide deletion in the coding region of the gene for the protein’s bHLH domain, leading to the formation of a premature stop codon.
In my thesis project, I carried out a phenotypic characterisation of the F2 and F3 generations of the mutant line, focusing more on neurodevelopment and using immunohistochemistry techniques to search for possible differences between the heterozygous mutant individuals and controls in order to validate our line as a model of the disease. The tcf4+/- embryos were fixed at different stages of development, specifically at 3 dpf (days post fertilisation), 4 dpf and 5 dpf, and I tested various markers on them. Through these investigations, I was able to identify alterations in the craniofacial skeleton, such as a significant reduction in the size of cartilaginous structures in heterozygotes, and observe phenotypes at more advanced and later larval stages, trying to identify the time window in which the loss of TCF4 function alters craniofacial development. The results presented in this thesis suggest that TCF4 acts upstream of the master regulator of chondrogenesis Sox9. I also observed a reduction in size of a specific brain area, the abenula, which is involved in the regulation of behavioural processes, especially in the social sphere. Finally, I carried out investigations at the intestinal level, as one of the recurring clinical signs in Pitt-Hopkins patients is a reduction in intestinal peristalsis; these revealed a reduction in the number of enteric neurons in tcf4+/- individuals compared to tcf4+/+ controls.
The characterization of this TCF4 knockout model could be of significant importance for research on this rare genetic disease. A zebrafish model for Pitt-Hopkins could offer numerous advantages, as it may allow the investigation of aspects that are difficult, if not nearly impossible, to study in the existing mouse model. Furthermore, the disease model in zebrafish will be available to the entire scientific community for potential large-scale pharmacological testing.