ETD

• colorectal carcinoma
• comprehensive genomic profiling
• molecular biology
• predictive biomarkers
• target therapy

In recent years, the development and clinical implementation of targeted therapies and immunotherapies have significantly changed the therapeutic approach to metastatic colorectal carcinoma (mCRC), leading to substantial improvements in patient outcomes. In this context, molecular characterization plays a central role in guiding treatment decisions and enabling a precision medicine approach. Currently, the main predictive biomarkers used in clinical practice include activating mutations in the RAS and BRAF genes, NTRK gene rearrangements, and HER2 amplification for targeted therapies, while mismatch repair (MMR) status and microsatellite instability (MSI) are essential for immunotherapy selection.
However, current diagnostic algorithms, mainly based on small-to-medium NGS panels or single-gene assays, may not fully capture the molecular complexity of mCRC, particularly in advanced disease. In this setting, comprehensive genomic profiling (CGP), based on the simultaneous analysis of hundreds of genes using large NGS panels, represents a promising tool for achieving a broader and more in-depth molecular characterization, with potential diagnostic, prognostic, and therapeutic implications. Nevertheless, the actual clinical utility of CGP in routine mCRC management remains to be fully established.
The aim of this study was to evaluate the role of CGP in the molecular characterization of mCRC compared with standard first-level testing, with a focus on identifying additional potentially targetable alterations in both RAS/BRAF wild-type and mutated tumors. Furthermore, the study aimed to identify genomic alterations associated with resistance to therapies, particularly anti-EGFR agents, and to assess their impact on clinical outcomes, including progression-free survival (PFS) and overall survival (OS). Finally, the utility of CGP in evaluating predictive biomarkers of response to immunotherapy was investigated, with particular attention to MSI/MMR status, tumor mutational burden (TMB), and POLE/POLD1 mutations.
A retrospective, single-center cohort of 138 patients with mCRC was analyzed. Among these, 77 cases (55.8%) were RAS/BRAF wild-type, while 61 cases (44.2%) harbored mutations in these genes. In the RAS/BRAF wild-type group, CGP identified pathogenic variants in all cases and at least one potentially targetable alteration in 30% of patients, mainly involving the PIK3CA gene, as well as BRAF, MDM2, and PTEN. Similarly, in RAS/BRAF-mutated tumors, additional potentially targetable alterations were identified in 31% of cases, with a higher prevalence in PIK3CA and PTEN, highlighting the ability of CGP to expand therapeutic options even in this subgroup.
Regarding immunotherapy, CGP showed high concordance with standard methods in the assessment of MSI/MMR status while providing additional clinically relevant information, such as TMB and mutations in MMR genes. This integrated approach allowed the identification of additional patients potentially eligible for immunotherapy and facilitated the interpretation of discordant cases across different methodologies.
Survival analyses in RAS/BRAF wild-type patients treated with anti-EGFR antibodies demonstrated that the presence of resistance-associated genomic alterations was significantly associated with shorter progression-free survival (PFS), whereas no significant differences in overall survival (OS) were observed. This association was also confirmed in the subgroup of left-sided colon and rectal tumors. In RAS/BRAF-mutated patients treated with systemic chemotherapy combined with bevacizumab, the presence of resistance-associated alterations was associated with improved PFS in patients receiving triplet chemotherapy compared with doublet regimens, whereas in patients without such alterations, doublet chemotherapy showed comparable or more favorable outcomes.
Overall, the results of this study indicate that a more comprehensive molecular characterization through CGP may improve the clinical management of patients with mCRC. In particular, CGP enables the identification of a substantial proportion of additional targetable alterations, refines patient selection for targeted therapies, and enhances the understanding of resistance mechanisms. Moreover, the ability of CGP to assess, in addition to MSI status, other predictive biomarkers of response to immunotherapy, such as TMB and POLE/POLD1 mutations, may contribute to increasing the identification of patients eligible for immune checkpoint inhibitor treatment.
Although limited by the retrospective design and the relatively small sample size, these findings support the potential role of CGP in clinical practice and highlight the need for further studies to evaluate its impact on clinical outcomes and cost-effectiveness.

Negli ultimi anni, lo sviluppo e l’introduzione nella pratica clinica di terapie a bersaglio molecolare e di immunoterapie hanno profondamente modificato l’approccio terapeutico al carcinoma del colon-retto metastatico (mCRC), migliorando in maniera significativa la prognosi dei pazienti. In questo contesto, la caratterizzazione molecolare dei tumori riveste un ruolo centrale nella definizione della strategia terapeutica più appropriata, consentendo un approccio di medicina di precisione. Attualmente, i principali biomarcatori predittivi utilizzati nella pratica clinica includono le mutazioni attivanti dei geni RAS e BRAF, i riarrangiamenti dei geni NTRK e l’amplificazione del gene HER2 per quanto riguarda le terapie a bersaglio molecolare, mentre per l’immunoterapia è fondamentale la valutazione dello stato del sistema del mismatch repair (MMR) e dell’instabilità dei microsatelliti (MSI).
Tuttavia, gli attuali algoritmi diagnostici, basati prevalentemente su pannelli NGS di dimensioni medio-piccole o su metodiche a singolo gene, potrebbero non essere sufficienti a cogliere la complessità del profilo molecolare del mCRC, soprattutto nei casi avanzati. In questo scenario, il comprehensive genomic profiling (CGP), basato sull’analisi simultanea di centinaia di geni mediante pannelli NGS estesi, rappresenta uno strumento potenzialmente in grado di fornire una caratterizzazione molecolare più ampia e approfondita, con possibili implicazioni diagnostiche, prognostiche e terapeutiche. Nonostante ciò, il reale impatto clinico della CGP nella gestione routinaria del mCRC non è ancora completamente definito.
L’obiettivo della presente tesi è stato quello di valutare il ruolo della CGP nella caratterizzazione molecolare del mCRC rispetto alle indagini di primo livello, con particolare attenzione all’identificazione di ulteriori alterazioni potenzialmente targettabili sia nei tumori RAS/BRAF wild-type sia mutati. Inoltre, lo studio ha mirato a identificare alterazioni genomiche associate a resistenza ai trattamenti, in particolare agli anticorpi anti-EGFR, e a valutarne l’impatto sugli outcome clinici, in termini di progression-free survival (PFS) e overall survival (OS). Infine, è stata analizzata l’utilità della CGP nella valutazione dei biomarcatori predittivi di risposta all’immunoterapia, con particolare riferimento allo stato MSI/MMR, al tumor mutational burden (TMB) e alle mutazioni dei geni POLE/POLD1.
Lo studio è stato condotto su una coorte retrospettiva monocentrica di 138 pazienti con mCRC. Tra questi, 77 casi (55,8%) sono risultati RAS/BRAF wild-type, mentre 61 casi (44,2%) presentavano mutazioni in tali geni. Nei tumori RAS/BRAF wild-type, la CGP ha identificato varianti patogeniche in tutti i casi e almeno un’alterazione potenzialmente targettabile nel 30% dei pazienti, principalmente a carico del gene PIK3CA, ma anche di altri geni quali BRAF, MDM2 e PTEN. Analogamente, nei tumori RAS/BRAF mutati, ulteriori alterazioni potenzialmente targettabili sono state identificate nel 31% dei casi, con una maggiore prevalenza nei geni PIK3CA e PTEN, evidenziando come la CGP possa ampliare le opzioni terapeutiche anche in questa categoria di pazienti.
Per quanto riguarda l’immunoterapia, la CGP ha mostrato un’elevata concordanza con le metodiche standard nella valutazione dello stato MSI/MMR, fornendo al contempo informazioni aggiuntive clinicamente rilevanti, quali il TMB e la presenza di mutazioni nei geni del sistema MMR. Questo approccio integrato ha consentito di identificare ulteriori pazienti potenzialmente candidabili a trattamenti immunoterapici e di meglio interpretare i casi discordanti tra le diverse metodiche.
Le analisi di sopravvivenza nei pazienti RAS/BRAF wild-type trattati con anticorpi anti-EGFR hanno evidenziato che la presenza di alterazioni genomiche associate a resistenza era significativamente correlata a una riduzione della progression-free survival (PFS), mentre non sono emerse differenze significative in termini di overall survival (OS). Tale associazione è risultata confermata anche nel sottogruppo dei tumori del colon sinistro e del retto. Nei pazienti con mCRC RAS/BRAF mutato trattati con chemioterapia sistemica associata a bevacizumab, è emerso che, in presenza di alterazioni genomiche associate a resistenza, il trattamento con chemioterapia triplet era associato a una migliore PFS rispetto alla doppietta, mentre nei pazienti privi di tali alterazioni la doppietta mostrava risultati comparabili o più favorevoli.
Nel complesso, i risultati di questo studio indicano che una caratterizzazione molecolare più estesa mediante CGP può contribuire a migliorare la gestione clinica dei pazienti con mCRC. In particolare, la CGP consente di identificare un numero non trascurabile di alterazioni potenzialmente targettabili, di affinare la selezione dei pazienti candidabili a terapie mirate e di approfondire i meccanismi molecolari alla base della resistenza ai trattamenti. Inoltre, la possibilità offerta dalla CGP di valutare, oltre allo stato MSI, anche ulteriori biomarcatori predittivi di risposta all’immunoterapia, quali il TMB e le mutazioni dei geni POLE/POLD1, può contribuire ad aumentare l’identificazione dei pazienti eleggibili al trattamento con inibitori dei checkpoint immunitari.
Sebbene i risultati siano limitati dal disegno retrospettivo e dalla dimensione relativamente contenuta del campione, essi supportano il potenziale ruolo della CGP nella pratica clinica e sottolineano la necessità di ulteriori studi per valutarne l’impatto in termini di outcome clinici e costo-efficacia.