• Botrytis cinerea
• cellulosa
• colonne macro-spin
• produzione dsRNA
• protezione colture
• purificazione
• RNAi

Botrytis cinerea è un fungo patogeno che attacca numerose specie vegetali. L’uso di fungicidi è il metodo principale per la difesa da B. cinerea che, tuttavia, sviluppa rapidamente ceppi resistenti. Tra le strategie alternative di difesa quella basata sull’interferenza dell’RNA (RNAi) consente di silenziare l'espressione di geni del patogeno. L'RNAi è un processo innescato da un RNA a doppio filamento (dsRNA) che porta alla degradazione dell'mRNA bersaglio. Lo scopo del lavoro è stato quello di ottimizzare la purificazione del dsRNA prodotto in vivo con ceppi di Escherichia coli trasformati, mediante estrazione in fase solida (SPE) e testarne l’efficacia su foglie di lattuga.
Il sistema L4440-HT115(DE3) è stato indotto con IPTG alla produzione di BcBmp1, BcBmp3, BcPls1 e GFP dsRNA in Terrific Broth raccogliendo i pellet batterici dopo 2 e 4 ore.
L’estrazione degli acidi nucleici è stata eseguita con tampone CTAB a due pH diversi modificando anche alcuni parametri della purificazione mediante SPE (Prova 1 e Prova 2).
Nella Prova 1 la quantità di dsRNA estratto è risultata superiore sia a 2 che a 4 ore dall’induzione per quasi tutti i geni. Complessivamente nelle due prove la resa di dsRNA è stata tra 0,3 e 3,2 µg/ml di coltura batterica. L’analisi elettroforetica ha evidenziato che la Prova 2 ha prodotto dsRNA di maggiore qualità. Il trattamento di foglie di lattuga con i dsRNA ha ridotto significativamente i sintomi della malattia con valori di efficacia compresi tra 64 e 77%.