• Aβ
• mass spectrometry
• MCI
• OSAS
• tau

La sindrome delle apnee ostruttive del sonno (Obstructive Sleep Apnea Syndrome, OSAs) è una condizione patologica caratterizzata da episodi ripetitivi di ostruzione parziale o completa delle vie respiratorie superiori durante le ore notturne, che si presenta con almeno cinque o più eventi respiratori ostruttivi all’ora.
Le apnee notturne sono associate a desaturazioni intermittenti di ossigeno nel sangue, con conseguenti sintomi quali ripetuti risvegli notturni, russamento, cefalea al risveglio ed eccessiva sonnolenza diurna. Lo studio di questa patologia ha permesso di correlare l’OSAS ad una maggiore probabilità di sviluppare patologie cardiovascolari e metaboliche, tra cui l’ipertensione polmonare, malattie coronariche, aritmie e diabete di tipo 2. Oltre al maggiore rischio di eventi a carico del sistema vascolare sono stati evidenziate anche correlazioni tra l’OSAS e sintomi ansioso/depressivi.
Più recentemente, gli studi si stanno concentrando sull’eventuale implicazione dell’OSAS nello sviluppo di patologie che causano un deterioramento neuro-cognitivo. Gli episodi di ipossia cronica intermittente, la scarsa qualità del sonno ed i disturbi dell’umore, possono essere dei potenziali fattori di rischio per il declino cognitivo.
L’OSAS è infatti prevalente nel 27% dei pazienti con MCI (Mild Cognitive Impairment), ovvero il declino cognitivo lieve, definito come uno stadio pre-demenza che comporta una alterazione dei domini cognitivi in forma più o meno grave, e che viene indagato come caratteristica prodromica allo sviluppo di patologie neurodegenerative come la malattia di Alzheimer (Alzheimer’s Disease, AD) o il morbo di Parkinson (Parkinson’s Disease, PD).
Tali considerazioni rendono essenziale il riconoscimento precoce dell’MCI per poter contrastare l’insorgenza di problematiche più gravi. Tra le strategie diagnostiche del declino cognitivo lieve vi è l’uso di marcatori genetici, proteomici e di imaging. Negli ultimi anni, si sono rivelati di particolare importanza gli studi di biomarcatori nei fluidi corporei, con particolare interesse per il liquor cefalorachidiano (cerebrospinal fluid, CFS) ed il sangue, e in specifiche regioni cerebrali per poter consentire il rilevamento precoce delle alterazioni cognitive.
I biomarcatori descritti per la diagnosi di MCI possono essere classificati attraverso lo schema A/T/N, proposto dal National Institute on Aging Alzheimer’s Association (NIA-AA), redendolo utile per la previsione della demenza su un singolo individuo.
In questo schema la lettera “A” corrisponde alla proteina β-Amiloide (Aβ), la lettera “T” corrisponde alla proteina Tau, che sono i due hallmarks patologici di AD, e la lettera “N” sta per neurodegenerazione. Questo sistema viene organizzato attraverso la misurazione di queste due proteine nel plasma e nel liquido cerebrospinale, nonché attraverso analisi di imaging.
Essendo la diagnosi precoce fondamentale per un intervento terapeutico mirato ed efficace, c’è grande interesse nel campo della ricerca scientifica per innovativi approcci diagnostici che permettano di rilevare un aumento del rischio di sviluppo di queste patologie. Sebbene gli studi si siano rivelati attendibili per quanto riguarda la correlazione tra i biomarcatori nel liquido cerebrospinale e la progressione del declino cognitivo, il prelievo di quest’ultimo attraverso rachicentesi risulta essere invasivo, compromettendo la compliance del paziente; per questo motivo negli ultimi anni l’attenzione si è spostata verso l’indagine dei biomarcatori in fluidi periferici come il sangue ed in particolare il plasma, essendo il prelievo venoso meno invasivo per il paziente, oltre che più economico e veloce.
Lo scopo di questo progetto di tesi si è infatti incentrato sullo studio di un protocollo per la rilevazione qualitativa e semi-quantitativa di proteine Aβ e Tau nel plasma umano tramite spettrometria di massa, affiancato dall’analisi quantitativa delle proteine identificate come biomarcatori tramite saggio immunoenzimatico (ELISA).
I campioni di plasma sono stati isolati da sangue intero di pazienti con diagnosi di OSAS (in collaborazione con l’Unità di Neurologia dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, AOUP, di Pisa) e conservati a -80°C. Il plasma è stato poi purificato attraverso l’utilizzo del kit PureProteomeTM per rimuovere albumine ed immunoglobuline, maggiormente presenti nel plasma (75-80%) che potevano altrimenti andare a mascherare la presenza e quindi il rilevamento delle proteine di interesse, e successivamente concentrato in colonne Amicon® Ultra. Una volta effettuata la purificazione e la concentrazione è stato effettuato il dosaggio delle proteine totali con metodo di Bradford. Le proteine contenute nei campioni di plasma sono state separate tramite corsa elettroforetica su gel di Tris-Glicina 12% per la proteina Tau e gel di Tris-Tricina 16,5% per la proteina Aβ, in condizioni denaturanti. In ciascun gel è stato anche caricato lo standard di riferimento, ovvero la proteina Tau o la proteina Aβ opportunamente trattate.
Una volta effettuata la corsa elettroforetica, il gel e stato colorato in Coomassie Brilliant Blue per 1h e successivamente decolorato con una soluzione di Destaining per almeno 12h. Questo processo ha permesso di rendere visibili per proteine presenti nei campioni di plasma nel gel di elettroforesi. Si è quindi proceduto con l’estrazione delle proteine dalle bande del gel. In particolare, le bande di interesse, ovvero quelle corrispondenti alle proteine Tau e Aβ presenti nei campioni di plasma, sono state tagliate e lavate con acqua purificata ed acetonitrile per poi procedere con una digestione in-situ con tripsina. Successivamente i campioni sono stati ulteriormente trattati e, una volta concluso il protocollo di estrazione, sono stati liofilizzati ed analizzati attraverso un sistema di cromatografia liquida (Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) accoppiato a una spettrometria di massa ad alta risoluzione (HR-MS) Q Exactive Plus Orbitrap, dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) e di un analizzatore ibrido a quadrupolo (UHPLC-HR-ESI-MS/MS).
In parallelo, i campioni di plasma sono stati utilizzati per la quantificazione delle proteine Tau e Aβ tramite un dosaggio ELISA home-made.
I dati ottenuti dimostrano che è possibile effettuare un’analisi qualitativa delle proteine Tau e Aβ nei campioni di plasma di pazienti affetti da OSAS attraverso spettrometria di massa nano-LC; tuttavia, la tecnica ELISA rimane essenziale per valutare quantitativamente le proteine in analisi dei campioni di plasma.
Dati i promettenti risultati ottenuti, ulteriori studi saranno necessari per validare la combinazione di queste due tecniche per effettuare un’analisi qualitativa e quantitativa di questi ed altri possibili biomarcatori plasmatici in pazienti con OSAS per un possibile scopo diagnostico e/o prognostico.