Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Titolo
Sviluppo e validazione di un metodo RP-HPLC-FLD per la determinazione di composti tiolici in matrici biologiche e applicazione a modelli di cellule di adenocarcinoma polmonare
Dipartimento
CHIMICA E CHIMICA INDUSTRIALE
Riassunto (Italiano)
La presente tesi ha avuto come obiettivo principale lo sviluppo, l’ottimizzazione e la validazione di un metodo analitico basato sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa accoppiata a rivelazione fluorimetrica (RP-HPLC-FLD) per la determinazione di composti tiolici in matrici biologiche complesse. In particolare, il lavoro si è concentrato sull’analisi di tioli a basso peso molecolare e di specie tioliche proteiche in modelli cellulari di adenocarcinoma polmonare, sia a livello intracellulare (lisati cellulari) sia extracellulare (mezzo di coltura).
I composti tiolici rivestono un ruolo centrale nei sistemi biologici, in quanto partecipano ai principali meccanismi di difesa antiossidante, al controllo dell’omeostasi redox e alla regolazione di numerosi pathway di signalling cellulare. La loro elevata reattività nei confronti di specie ossidanti, quali le Reactive Oxygen Species (ROS), le Reactive Nitrogen Species (RNS) e le Reactive Sulfur Species (RSS), li rende particolarmente sensibili alle variazioni dello stato redox cellulare, ma al contempo rende complessa la loro determinazione analitica, soprattutto in matrici biologiche ad elevata complessità. Per tale ragione, la messa a punto di metodi analitici sensibili, selettivi e riproducibili per la determinazione dei tioli rappresenta un ambito di grande interesse chimico bioanalitico.
Il lavoro di tesi si è focalizzato sull’impiego della derivatizzazione pre colonna con monobromobimano (mBBr), una sonda fluorescente ampiamente utilizzata per l’analisi dei composti tiolici. Il mBBr reagisce selettivamente con i gruppi –SH formando derivati tioeterei fluorescenti stabili, caratterizzati da una maggiore idrofobicità rispetto ai tioli nativi. Questa proprietà consente un miglioramento della ritenzione e della separazione cromatografica in fase inversa, nonché una significativa riduzione delle interferenze di matrice, rendendo il reagente particolarmente adatto all’analisi di campioni biologici complessi. Inoltre, l’accoppiamento della derivatizzazione con la rivelazione fluorimetrica permette di raggiungere limiti di rilevazione dell’ordine dei nanomolari, garantendo un’elevata sensibilità e selettività analitica.
Nonostante i numerosi vantaggi, la derivatizzazione con monobromobimano presenta alcune criticità legate alla dipendenza delle prestazioni analitiche dalle condizioni sperimentali e, ancorché impiegata in letteratura, è di interesse lo studio sistematico delle condizioni di reazione. La reazione è infatti fortemente influenzata dal pH del mezzo di reazione, in quanto richiede la deprotonazione del gruppo tiolico per procedere in modo efficiente; la cinetica risente inoltre della pKa del gruppo –SH, del grado di ingombro sterico del tiolo, dell’eccesso molare del reagente, del tempo di incubazione e della temperatura. In letteratura sono riportate numerose procedure analitiche che differiscono sensibilmente per quanto riguarda questi parametri, applicate a matrici quali plasma, sangue, lisati cellulari e tessutali di origine umana e vegetale. Tale eterogeneità evidenzia la mancanza di un protocollo univoco e validato, in particolare per la determinazione del contenuto totale di tioli comprendente sia le forme ridotte sia quelle ossidate.
Alla luce di queste considerazioni, uno degli obiettivi fondamentali della tesi è stato lo sviluppo di un protocollo analitico robusto e riproducibile. Il metodo è stato ottimizzato studiando sistematicamente le principali variabili sperimentali che influenzano l’efficienza della derivatizzazione con mBBr, quali il pH del buffer di reazione, l’eccesso molare del reagente, il tempo e la temperatura di incubazione e la stabilità dei derivati formati. Particolare attenzione è stata dedicata alla riduzione delle interferenze di matrice e alla definizione di condizioni sperimentali che garantissero un’adeguata selettività nei confronti degli analiti di interesse.
Un ulteriore aspetto rilevante del lavoro ha riguardato la determinazione del contenuto totale di tioli, comprensivo delle forme ossidate. A tal fine è stata ottimizzata una fase preliminare di riduzione dei campioni mediante tris(2 carbossietil)fosfina (TCEP), un agente riducente stabile ed efficace. Le condizioni operative della fase di riduzione sono state definite impiegando un approccio di Design of Experiments (DOE), che ha permesso di valutare in modo statistico l’influenza di parametri quali tempo e temperatura di reazione sull’efficienza del processo, contribuendo a migliorare l’affidabilità complessiva del metodo.
Il metodo sviluppato è stato successivamente validato secondo i principali parametri richiesti dalle linee guida per la validazione dei metodi analitici, includendo linearità, sensibilità, precisione, accuratezza, limiti di rilevabilità e di quantificazione. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il metodo presenta buone prestazioni analitiche ed è adeguato all’analisi di campioni biologici reali, confermandone l’idoneità per studi applicativi in ambito biochimico e biomedico.
Una volta ottimizzato e validato, il protocollo è stato applicato allo studio di matrici biologiche complesse ottenute da modelli cellulari di adenocarcinoma polmonare non a piccole cellule (non small cell lung cancer, NSCLC). Questo tipo di tumore rappresenta circa l’85% dei tumori polmonari e presenta frequentemente mutazioni del gene EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), che portano alla formazione di una proteina iperattiva coinvolta nella proliferazione tumorale. In particolare, è stata studiata la linea cellulare H1975, caratterizzata dalla presenza delle mutazioni L858R e T790M del gene EGFR, responsabili rispettivamente dell’attivazione costitutiva del recettore e della resistenza ai farmaci inibitori della tirosin chinasi.
Nel corso dello studio sono state analizzate due tipologie di campioni: cellule tumorali parentali non trattate con farmaco e cellule trattate a lungo termine (4 mesi) con Osimertinib e divenute resistenti al farmaco analizzate dopo wash out di 3 giorni dal trattamento farmacologico. L’applicazione del metodo ha consentito di valutare il profilo dei composti tiolici sia a livello intracellulare sia extracellulare, evidenziando differenze significative tra le diverse condizioni sperimentali e suggerendo un possibile ruolo dei tioli nei meccanismi di adattamento e resistenza farmacologica.
Infine, considerando l’efficace utilizzo del monobromobimano per la determinazione dei tioli a basso peso molecolare, un ulteriore obiettivo della tesi è stato l’esplorazione dell’applicabilità della derivatizzazione con mBBr allo studio di proteine tioliche. In letteratura sono riportati pochi esempi di derivatizzazione di proteine con mBBr seguita da analisi RP-HPLC-FLD. Nel presente lavoro è stata quindi valutata la possibilità di derivatizzare una serie di proteine standard, con l’obiettivo finale di estendere il metodo alla quantificazione di proteine contenenti gruppi –SH liberi nei lisati cellulari di modelli NSCLC parentali e resistenti.
Nel complesso, la tesi ha contribuito allo sviluppo di un metodo analitico affidabile per la determinazione dei composti tiolici in matrici biologiche complesse
