• drug repurposing
• SARS-CoV-2
• terapia antivirale
• vettori lentivirali pseudotipizzati
• COVID-19

SARS-CoV-2 è un virus a RNA a polarità positiva appartenente all’ordine Nidovirales e alla famiglia Coronaviridae. È stato isolato in Cina nel gennaio del 2020 e ha causato la pandemia da COVID-19. Si tratta di un virus ad alta patogenicità e trasmissibilità, per questo SARS-CoV-2 è classificato come agente patogeno con un livello di biosicurezza 3 (BSL-3), utilizzabile quindi solo in un laboratorio appositamente attrezzato.
Per ovviare a questo problema e studiare la fase di ingresso del virus nella cellula è possibile ricorrere all’uso di vettori lentivirali pseudotipizzati (PLV), che possono essere manipolati anche in BSL-1 e BSL-2. Un PLV è una particella virale che possiede le proteine strutturali di un Lentivirus e la glicoproteina recettoriale S di SARS-CoV-2, avrà la struttura di un Lentivirus ma il tropismo di SARS-CoV-2 e si legherà quindi alla proteina hACE2. Il genoma di un PLV presenta alle estremità due sequenze long terminal repeat (LTR) ma non codifica più nessun gene di HIV, contiene solo una cassetta di espressione per un gene reporter, quindi non è in grado di replicarsi.
Lo scopo della tesi è quello di valutare l’attività di un pannello di composti antivirali, sintetizzati dall’Università di Sassari, nei confronti dell’ingresso di SARS-CoV-2.
Innanzitutto, è stato ottimizzato un protocollo per la produzione dei vettori pseudotipizzati con la proteina S di SARS-CoV-2 (PLV-S) o con la glicoproteina G del virus della stomatite vescicolare (PLV-VSV-G) da utilizzare come controllo positivo.

Per migliorare l’efficienza di trasduzione da parte dei PLV-S sono state trasfettate stabilmente le cellule HEK-293T, con un plasmide codificante per il recettore di SARS-CoV-2, ACE2, ottenendo la linea cellulare HEK-293T/ACE2. Per validare il fatto che i PLV-S riproducessero il meccanismo di entrata del virus SARS-CoV-2, è stato fatto un test di neutralizzazione utilizzando campioni di siero provenienti da pazienti vaccinati contro COVID-19.
A questo punto sono stati fatti saggi di citotossicità dei composti sulle cellule HEK-293T/ACE2 e dai risultati ottenuti sono state scelte 2 concentrazioni a cui effettuare il test di tutti i composti (5 µM e 0,5 µM). La valutazione dei composti è stata fatta utilizzando PLV-S con gene reporter luciferasi di lucciola in modo da valutare la loro efficacia tramite un luminometro in termini di unità di luce relativa (RLU). Tra tutti i composti ne sono stati scelti 6 che sembravano inibire l’ingresso dei PLV-S nelle cellule HEK-293T/ACE2 e sono stati ulteriormente testati a diverse concentrazioni (50, 10, 2, 0.4, 0.08 µM) per calcolare la concentrazione inibente il 50% dell’ingresso (IC50). Con i 2 composti più promettenti messi in evidenza da questo ultimo saggio, sono stati effettuati anche dei saggi di riduzione delle placche litiche con i virus CoxsackieB5 e VSV per capire se i composti fossero specifici per SARS-CoV-2 o fossero efficaci anche contro virus diversi. Infine, le cellule HuH7 sono state infettate con SARS-CoV-2 a due concentrazioni di farmaco (50 e 100 µM) e, per vedere l’effetto antivirale dei composti, è stato estratto l’RNA genomico dal surnatante delle cellule infettate per fare una qPCR, il substrato cellulare invece è stato lisato ed è stato effettuato un Western Blot per visualizzare le proteine virali. Come ultima esperimento, sempre con questi due composti, è stato effettuato un saggio del tempo di somministrazione, pre-trattando le cellule con il farmaco o somministrandoo dopo la trasduzione, per capire quale fosse il momento migliore per intervenire inibendo l’infezione.