ETD

• Limnospira Platensis

This doctoral research thesis investigates mixotrophic cultivation strategies for the cyanobacterium Arthrospira platensis to enhance biomass productivity and improve the yield and purity of C‑phycocyanin (C‑PC), a pigment with high nutraceutical and pharmaceutical potential. Within a circular bio‑economy framework, the work exploits agro‑industrial effluents as low‑cost carbon sources, aligning waste valorization with microalgal processes. Cultivations were conducted in sterilized closed photobioreactors supplied by Teregroup, which reduce contamination risks and enable tight control of operating parameters, supporting higher productivity than traditional open systems. The first experimental phase evaluated cheese whey (CW), a lactose‑rich dairy byproduct, as a carbon source for mixotrophic growth. CW markedly enhanced biomass productivity compared with photoautotrophic controls, exceeding values reported for Spirulina grown in generic dairy wastewaters. It also increased pigment accumulation, providing C‑PC with analytical purity compatible with pharmaceutical use. A second phase compared buffalo dairy byproducts from a DOP‑certified supply chain—scotta whey (SW), buttermilk wastewater (BMW) and dairy wastewater (DWW)—to identify effluents suitable for scale‑up. Cultures supplemented with 1% BMW showed the highest C‑PC levels, suggesting that its balanced content of residual sugars, lipids and proteins favours phycobiliprotein biosynthesis. In contrast, SW yielded the lowest pigment levels. Overall, reduced effluent concentrations (0.5–2%) were sufficient to stimulate C‑PC synthesis without impairing growth. A third line of work investigated brewery wastewaters (BWW), characterized by high concentrations of fermentable carbon and nitrogen. Because elevated organic loads can negatively affect microalgal cultures, BWW with a TOC of about 11.2 g/L were used at 2%, in line with recommendations to avoid inhibitory effects. Under these conditions, mixotrophic cultivation produced roughly 50% more biomass than photoautotrophic controls, confirming the suitability of appropriately diluted brewery effluents as substrates for microalgal production. The addition of seawater induced moderate salinity stress, which further enhanced both accumulation and purity of C‑PC, consistent with evidence that salt stress in mixotrophic Arthrospira cultures can improve phycocyanin content and modulate metabolite profiles. Building on these optimized cultivation protocols, the thesis then focused on the functional characterization of the resulting biomass, with emphasis on antioxidant and anti‑inflammatory activities. Phycocyanin‑rich extracts from Spirulina are known to exert strong antioxidant and cytoprotective effects, and this research aimed to link culture conditions with biological performance. Aqueous and lyophilized extracts from the same mixotrophic cultures were evaluated at the University of Pisa using standard DPPH and ABTS assays. Both extract types showed comparable phycobiliprotein content and C‑PC purity, while aqueous extracts tested negative in polyphenol detection assays, indicating that radical‑scavenging activity arises predominantly from proteinaceous pigments rather than phenolic compounds. These results support a synergistic contribution of different phycobiliproteins to antioxidant activity and confirm that salinity stress combined with mixotrophic growth promotes the accumulation of secondary metabolites with enhanced antioxidant potential. Finally, the thesis included a comprehensive evaluation of polysaccharide‑enriched extracts obtained from Spirulina cultures grown under photoautotrophic and mixotrophic conditions, using mammalian cell models to assess their protective effects. Experiments were performed on human keratinocytes (HaCaT cells) exposed to lipopolysaccharide (LPS) and tumour necrosis factor‑alpha (TNF‑α), which induce oxidative and inflammatory stress. Polysaccharide extracts obtained from both cultivation methods showed marked antioxidant and anti-inflammatory activity, while those derived from mixotrophic cultures showed comparable or superior efficacy in attenuating LPS- and TNF-α-induced cell damage. Pretreatment with these extracts significantly reduced IL-1β and IL-6 secretion from basal levels, while the mixotrophic polysaccharide fraction consistently outperformed the photoautotrophic one. Collectively, the findings demonstrate that integrating agro‑industrial effluents into controlled mixotrophic systems not only improves C‑PC production and purity but also yields bioactive pigment and polysaccharide fractions with promising therapeutic potential, reinforcing Arthrospira platensis as a versatile platform for sustainable health‑oriented bioproducts.

Questa tesi di ricerca dottorale indaga le strategie di coltivazione mixotrofe della cianobatteria Arthrospira platensis al fine di incrementare la produttività della biomassa e migliorare la resa e la purezza della C‑ficocianina (C‑PC), un pigmento ad alto potenziale nutraceutico e farmaceutico. All’interno di un quadro di bioeconomia circolare, il lavoro sfrutta reflui agro‑industriali come fonti di carbonio a basso costo, integrando la valorizzazione degli scarti con i processi microalgali.

Le coltivazioni sono state condotte in fotobioreattori chiusi e sterilizzati forniti da Teregroup, che riducono il rischio di contaminazione e consentono un controllo preciso dei parametri operativi, supportando una produttività superiore rispetto ai sistemi aperti tradizionali. La prima fase sperimentale ha valutato il siero di latte (CW), sottoprodotto lattiero‑caseario ricco in lattosio, come fonte di carbonio per la crescita mixotrofa. Il CW ha incrementato significativamente la produttività della biomassa rispetto ai controlli fotoautotrofi, superando i valori riportati per Spirulina coltivata in acque reflue casearie generiche. Inoltre, ha favorito l’accumulo di pigmenti, fornendo C‑PC con purezza analitica compatibile con l’uso farmaceutico.

Una seconda fase ha confrontato sottoprodotti lattiero‑caseari di bufala provenienti da una filiera DOP certificata — siero di scotta (SW), acque di burro (BMW) e acque reflue casearie (DWW) — per identificare i reflui più idonei alla scala industriale. Le colture integrate con 1% di BMW hanno mostrato i livelli più elevati di C‑PC, suggerendo che il suo contenuto equilibrato di zuccheri, lipidi e proteine residui favorisca la biosintesi delle ficobiliproteine. Al contrario, il SW ha prodotto le concentrazioni più basse di pigmenti. Complessivamente, concentrazioni ridotte di effluenti (0,5–2%) sono risultate sufficienti a stimolare la sintesi di C‑PC senza compromettere la crescita.

Una terza linea di ricerca ha esaminato le acque reflue di birrifici (BWW), caratterizzate da elevate concentrazioni di carbonio e azoto fermentescibili. Poiché carichi organici troppo alti possono influire negativamente sulle colture microalgali, le BWW con un TOC di circa 11,2 g/L sono state utilizzate al 2%, in conformità con le raccomandazioni per evitare effetti inibitori. In queste condizioni, la coltivazione mixotrofa ha prodotto circa il 50% di biomassa in più rispetto ai controlli fotoautotrofi, confermando l’idoneità dei reflui birrari opportunamente diluiti come substrati produttivi per microalghe. L’aggiunta di acqua marina ha indotto un moderato stress salino, che ha ulteriormente incrementato sia l’accumulo sia la purezza della C‑PC, in linea con evidenze secondo cui lo stress salino nelle colture mixotrofe di Arthrospira può migliorare il contenuto di ficocianina e modulare i profili metabolici.

Sulla base dei protocolli di coltivazione ottimizzati, la tesi si è poi concentrata sulla caratterizzazione funzionale della biomassa ottenuta, con particolare attenzione alle attività antiossidante e anti‑infiammatoria. Gli estratti ricchi in ficocianina di Spirulina sono noti per esercitare marcati effetti antiossidanti e citoprotettivi, e questa ricerca ha mirato a correlare le condizioni di coltura con le prestazioni biologiche. Gli estratti acquosi e liofilizzati provenienti dalle medesime colture mixotrofe sono stati valutati presso l’Università di Pisa mediante i test standard DPPH e ABTS. Entrambi i tipi di estratto hanno mostrato contenuto di ficobiliproteine e purezza della C‑PC comparabili, mentre gli estratti acquosi sono risultati negativi nei test di rilevazione dei polifenoli, indicando che l’attività di scavenging dei radicali deriva prevalentemente dai pigmenti proteici piuttosto che da composti fenolici.

Questi risultati supportano un contributo sinergico di diverse ficobiliproteine all’attività antiossidante e confermano che lo stress salino, combinato con la crescita mixotrofa, promuove l’accumulo di metaboliti secondari ad elevato potenziale antiossidante. Infine, la tesi ha incluso una valutazione approfondita degli estratti polisaccaridici ottenuti da colture di Spirulina cresciute in condizioni fotoautotrofe e mixotrofe, utilizzando modelli cellulari di mammifero per valutarne gli effetti protettivi. Gli esperimenti sono stati condotti su cheratinociti umani (cellule HaCaT) esposti a lipopolisaccaride (LPS) e fattore di necrosi tumorale‑alfa (TNF‑α), i quali inducono stress ossidativo e infiammatorio. Gli estratti polisaccaridici ottenuti da entrambe le modalità di coltivazione hanno mostrato una marcata attività antiossidante e anti‑infiammatoria, mentre quelli derivati da colture mixotrofe hanno evidenziato efficacia pari o superiore nell’attenuare i danni cellulari indotti da LPS e TNF‑α.

Il pretrattamento con tali estratti ha ridotto significativamente la secrezione di IL‑1β e IL‑6 rispetto ai livelli basali, e la frazione polisaccaridica mixotrofa si è costantemente dimostrata più efficace rispetto a quella fotoautotrofa. Nel complesso, i risultati dimostrano che l’integrazione di reflui agro‑industriali in sistemi mixotrofi controllati non solo migliora la produzione e la purezza della C‑PC, ma genera anche frazioni pigmentarie e polisaccaridiche bioattive con promettente potenziale terapeutico, rafforzando Arthrospira platensis come piattaforma versatile per bioprodotti sostenibili orientati alla salute.