• Karl Fischer
• Liofili
• Visual Inspection

Il presente lavoro di tesi è stato svolto presso l’azienda biofarmaceutica Kedrion S.p.A., nel laboratorio di Analytical Development (AD) sezione chimica dello stabilimento di Bolognana, con l’obiettivo di sviluppare e convalidare metodi analitici che permettano di caratterizzare le proprietà chimico-fisiche di prodotti plasmaderivati ottenuti tramite bioprocessi farmaceutici. In particolare, il progetto ha riguardato l’analisi di prodotti liofili in fase di sviluppo, per i quali sono stati ottimizzati i metodi di determinazione dell’umidità residua e di valutazione dell’aspetto, sia del liofilo solido che della forma risospesa.
I principi attivi estratti dal plasma umano sono impiegati per il trattamento e la prevenzione di patologie e condizioni rare e gravi. L’isolamento di proteine terapeutiche dal plasma umano avviene mediante il processo di frazionamento, seguito da successivi step di purificazione e concentrazione. Al momento, l’azienda sta sviluppando un nuovo farmaco a base di fattore V della coagulazione liofilizzato.
La liofilizzazione è uno dei possibili metodi per la conservazione di prodotti plasmaderivati labili. Si tratta di un processo che prevede il congelamento del prodotto seguito dalla sublimazione dell'acqua sottovuoto, garantendo la conservazione a lungo termine del principio attivo.
Lo sviluppo di prodotti liofili richiede la progettazione di formulazioni che ne assicurino la stabilità e la qualità. Tra i parametri critici che caratterizzano un liofilo, in questo elaborato, sono stati presi in considerazione umidità residua e aspetto.
Un valore di umidità alterata può compromettere la stabilità e l’efficacia del prodotto, rappresentando un fattore limitante per la fruibilità del paziente finale. Nelle prime fasi di sviluppo, la misurazione di questo parametro fornisce informazioni importanti sulla qualità e sulla correttezza della formulazione, oltre che sul processo di liofilizzazione applicato. Tali conclusioni possono essere rafforzate dall’ispezione visiva del prodotto, perché una formulazione o processo di liofilizzazione non idonei possono produrre difetti estetici evidenti nell’aspetto del liofilo.
In tale ottica, è stata condotta una ricerca bibliografica, consultando sia la letteratura scientifica che le linee guida, al fine di valutare in modo critico le possibili alterazioni che potrebbero manifestarsi nel liofilo e nella forma risospesa. In seguito, è stata creata una scala cromatica, da usare come riferimento per campioni liofilizzati di fattore V.
Successivamente, sono state condotte numerose prove per ottenere il metodo più adatto alla quantificazione dell’umidità residua nei campioni liofili oggetto di studio, adottando come metodo analitico la titolazione Karl Fischer (KF) di tipo coulometrica. Questo metodo si basa sulla reazione redox di KF, in cui lo iodio, generato elettrochimicamente nella cella di titolazione, ossida l’anidride solforosa presente nel reagente, in presenza di acqua.
Per lo sviluppo del metodo, i test si sono concentrati sull’ottimizzazione di parametri, quali: temperatura di estrazione, modalità di interruzione dell’analisi, tempo minimo di analisi e tempo massimo di analisi. Le prove sono state condotte su standard a concentrazione nota di umidità residua per le titolazioni KF disponibili in commercio, un prodotto liofilo industriale commercializzato dall’azienda considerato come formulazione di riferimento e campioni liofili in fase di sviluppo.
Una volta individuato il metodo di riferimento, sono stati condotti dei test sperimentali volti a valutare aspetti chiave, quali: specificità, linearità, accuratezza, precisione, range, limite di rilevabilità (LOD), limite di quantificazione (LOQ) e robustezza.
I metodi sviluppati sono infine stati applicati con successo ad un prototipo pilota di fattore V plasmaderivato.