ETD

• ADMET
• Autophagy
• Caenorhabditis elegans
• Danio rerio
• Multitarget
• Neurodegeneration

Autophagy is one of the main biological processes involved in maintaining the cellular homeostasis. Indeed, autophagy dysregulation represents a common feature in many pathologies, such as cancer, metabolic disorders and neurodegenerative diseases (NDDs). Importantly, it is demonstrated that autophagy restoration is linked to neuroprotective effects on in vitro and in vivo models. Therefore, the aim of this research project is to develop novel pro-autophagic compounds endowed with neuroprotective activity to counteract neurodegeneration. To do so, I applied three different drug discovery approaches, namely target-based, phenotype-based and natural product-inspired approaches.
The target-based approach focused on developing novel allosteric AMPK activator. AMPK is an heterotrimeric kinase tightly involved in autophagy initiation, and so it represents an attractive protein to target for this research. Thanks to an in silico study we designed three series of benzimidazole-based structures capable of binding the allosteric pocket of AMPK. Nineteen compounds were synthesized and characterized. Subsequently, the obtained products were assessed for their early ADME-Tox properties. The panel of assays included cytotoxicity (A549 and HEK293 cell lines, 24h), potential cardiotoxicity (hERG-binding assay), off-target and epigenetic liability (HDAC6, HDAC8 inhibition assay) and preliminary ecotoxicity (Aliivibrio fischeri toxicity). Furthermore, with the aim of evaluating their ability to activate AMPK, I established an enzymatic protocol to apply in an in vitro assay. A small group of these small molecules were also tested in a cellular model able to detect the modulation of the autophagy flux.
The phenotype-based approach focused on modifying the structure of a diarylmethane derivative that demonstrated neuroprotective and pro-autophagic effects on in vitro and in vivo models, namely SG2. In fact, SG2 also showed a warning probability of cardiotoxicity during a preliminary ADME-Tox assessment. This result brought us to design novel diarylmethane derivatives inspired by SG2. Twelve new analogues were synthesized and characterized together with other two compounds which were already obtained, namely SG22 and SG23. All compounds have been tested for their ADME-Tox profile, also to evaluate their potential cardiotoxicity. A small group of the new derivatives were selected to be tested for their neuroprotective activities on two phenotype-based models for Alzheimer’s Disease (AD). Furthermore, due to a contraposition of in vitro and in vivo results of SG22, an in vivo uptake study was performed on a AD model of Caenorhabditis elegans. Besides this, since other NDDs are linked to autophagy disruption, a drug screening on a Danio rerio model for neuronal ceroid lipofuscinosis was run as well.
The natural product-inspired approach focused on designing and synthesizing novel analogues of urolithin A (UA). UA is a gut metabolite of ellagic acid, a polyphenol provided by natural sources, such as pomegranate, berries and nuts. UA is known for its multiple biological activities, including anti-inflammatory, antioxidant and pro-autophagic properties. Therefore, we selected UA’s scaffold as starting point of this drug design. The urolithin structure was combined with other pharmacophores or molecules capable of direct or indirect neuroprotective effects, namely short-chain fatty acids, polyamines, and the carbamate moiety of rivastigmine. Moreover, a small group of UA analogues was developed following an in silico screening with the aim of selectively targeting SIRT1, a known autophagy promoter. The biological evaluation of UA-inspired compounds included early ADME-Tox profiling, ecotoxicity activity, and both in vitro and in vivo neuroprotection. Furthermore, the most promising compound was evaluated for its ability to overcome the blood brain barrier.
The techniques and the protocol applied for both synthesis and biological evaluation of all the small molecules developed within this project are described in detail in the related PhD thesis.

L’autofagia rappresenta uno dei principali processi biologici coinvolti nel mantenimento dell’omeostasi cellulare. Infatti, la sua disregolazione costituisce una caratteristica comune in numerose patologie, quali il cancro, i disordini metabolici e le malattie neurodegenerative (NDDs). È stato inoltre dimostrato che il ripristino dell’autofagia è associato a effetti neuroprotettivi sia in modelli in vitro sia in vivo. Pertanto, l’obiettivo del presente progetto di ricerca è lo sviluppo di nuovi composti pro-autofagici dotati di attività neuroprotettiva, al fine di contrastare i processi neurodegenerativi. A tal fine, sono stati applicati tre distinti approcci di drug discovery: target-based, phenotype-based e natural product-inspired.

L’approccio target-based si è concentrato sullo sviluppo di nuovi attivatori allosterici di AMPK. AMPK è una chinasi eterotrimerica strettamente coinvolta nell’inizio dell’autofagia e rappresenta pertanto un bersaglio di grande interesse per questo studio. Grazie a uno studio in silico, sono state progettate tre serie di strutture basate sul nucleo benzimidazolico, in grado di legarsi alla tasca allosterica di AMPK. Diciannove composti sono stati sintetizzati e caratterizzati. Successivamente, i prodotti ottenuti sono stati valutati per le loro proprietà preliminari ADME-Tox. Il gruppo di test ha incluso saggi di citotossicità (linee cellulari A549 e HEK293, 24 h), potenziale cardiotossicità (saggio di legame hERG), effetti off-target ed epigenetici (saggi di inibizione di HDAC6 e HDAC8) e una valutazione preliminare dell’ecotossicità (tossicità su Aliivibrio fischeri). Inoltre, al fine di valutare la capacità dei composti di attivare AMPK, è stato sviluppato un protocollo enzimatico da applicare in un saggio in vitro. Un sottogruppo di queste piccole molecole è stato inoltre testato in un modello cellulare in grado di rilevare la modulazione del flusso autofagico.

L’approccio phenotype-based si è focalizzato sulla modifica strutturale di un derivato diarilmetanico che ha mostrato effetti neuroprotettivi e pro-autofagici in modelli in vitro e in vivo, denominato SG2. Tuttavia, SG2 ha evidenziato anche un elevato potenziale di cardiotossicità in una valutazione preliminare ADME-Tox. Questo risultato ha portato alla progettazione di nuovi derivati diarilmetanici ispirati a SG2. Dodici nuovi analoghi sono stati sintetizzati e caratterizzati, insieme ad altri due composti già ottenuti, SG22 e SG23. Tutti i composti sono stati sottoposti a valutazione del profilo ADME-Tox, anche al fine di indagarne la potenziale cardiotossicità. Un sottogruppo dei nuovi derivati è stato selezionato per essere testato in modelli phenotype-based della malattia di Alzheimer (AD), al fine di valutarne l’attività neuroprotettiva. Inoltre, a causa di risultati discordanti tra studi in vitro e in vivo relativi a SG22, è stato condotto uno studio di assorbimento utilizzando un modello di Caenorhabditis elegans per AD. Considerato che altre malattie neurodegenerative sono associate a disfunzioni dell’autofagia, è stato inoltre effettuato uno screening farmacologico su un modello di Danio rerio per la lipofuscinosi ceroide neuronale.

L’approccio natural product-inspired si è concentrato sulla progettazione e la sintesi di nuovi analoghi dell’urolitina A (UA). L’UA è un metabolita intestinale dell’acido ellagico, un polifenolo presente in fonti naturali quali melograno, bacche e frutta secca. L’UA è nota per le sue molteplici attività biologiche, tra cui proprietà antinfiammatorie, antiossidanti e pro-autofagiche. Pertanto, lo scaffold dell’UA è stato selezionato come punto di partenza per la progettazione dei nuovi composti. La struttura dell’urolitina è stata combinata con altri farmacofori o molecole dotate di effetti neuroprotettivi diretti o indiretti, quali acidi grassi a corta catena, poliamine e il gruppo carbammato della rivastigmina. Inoltre, un sottogruppo di analoghi dell’UA è stato sviluppato a seguito di uno screening in silico con l’obiettivo di modulare selettivamente SIRT1, un noto promotore dell’autofagia. La valutazione biologica dei composti ispirati all’UA ha incluso lo studio preliminare del profilo ADME-Tox, l’attività ecotossica e la valutazione della neuroprotezione sia in vitro sia in vivo. Inoltre, il composto più promettente è stato valutato per la sua capacità di attraversare la barriera emato-encefalica.

Le tecniche e i protocolli applicati sia per la sintesi sia per la valutazione biologica di tutte le piccole molecole sviluppate nell’ambito di questo progetto sono descritti in dettaglio nella relativa tesi di dottorato.