• alternative Splicing
• autoimmunità tiroidea
• breast cancer
• carcinoma mammario
• splicing alternativo
• thyroid autoimmunity
• thyroid peroxidase
• tireoperossidasi

RIASSUNTO (ITALIANO)
E’ nota l’esistenza di un’associazione tra il carcinoma mammario (CM) e le malattie benigne della tiroide, soprattutto autoimmuni; è stato inoltre osservato che le donne affette da CM aventi anticorpi anti-tireoperossidasi (AbTPO) circolanti hanno una prognosi migliore rispetto a quelle prive di AbTPO sierici.
Abbiamo pertanto ipotizzato la presenza di un antigene condiviso tra la cellula tiroidea e la cellula carcinomatosa mammaria come potenziale bersaglio di un’attività immunitaria umorale o cellulo-mediata. Gli antigeni candidati potrebbero essere il co-trasportatore sodio/iodio (NIS, espresso da entrambe le cellule), epitopi condivisi tra la tireoperossidasi (TPO) tiroidea e la lattoperossidasi (LPO) mammaria responsabili di un’immunità crociata, oppure la TPO stessa.
In considerazione dell’importante ruolo svolto dagli AbTPO, abbiamo verificato l’ultima ipotesi analizzando l’espressione della TPO in 3 linee cellulari di CM (MCF-7, T47-D, MDAMB-231), tessuti di CM, tessuto mammario peri-tumorale (PT), altri tessuti (tumorali e non) e tessuto tiroideo come controllo positivo.
Il gene della TPO è soggetto a splicing alternativo pertanto durante il processo di trascrizione genica vengono prodotte diverse isoforme mRNA mancanti di uno o più esoni. I trascritti mRNA delle varie isoforme di TPO, alcune già note ed altre mai descritte prima, sono stati riscontrati nei tessuti di CM (n=8) e PT (n=8) ma ad un livello di espressione 104 volte inferiore rispetto al tessuto tiroideo, mentre nelle 3 diverse linee cellulari di CM ed in tessuti tumorali diversi dal CM (n=5) erano espressi al limite della significatività. L’espressione delle isoforme mRNA della TPO è stata riscontrata anche nel tessuto adiposo (n=17), ad un livello di espressione 103 volte inferiore rispetto al tessuto tiroideo.
La proteina TPO di lunghezza completa del peso molecolare di 105-110 kDa è stata riscontrata con la metodica del Western Blot nella maggioranza delle linee cellulari e dei tessuti esaminati. Il pre-assorbimento dell’anticorpo monoclonale di topo anti-TPO con frammenti ricombinanti di TPO determinava una netta riduzione del segnale, indicando una specificità di legame; lo stesso pre-assorbimento dell’anticorpo con la LPO invece non determinava variazioni di segnale. Nei vari campioni esaminati sono state riscontrate anche bande di peso molecolare minore, il cui segnale si riduceva con pre-assorbimento dell’anticorpo monoclonale con TPO ma non con LPO; esse potrebbero rappresentare pertanto le proteine corrispondenti di isoforme mRNA del gene della TPO mancanti di uno o più esoni.
Con la metodica dell’immunofluorescenza indiretta utilizzando sieri di donne contenenti AbTPO ad alto titolo è stata dimostrata nel tessuto di CM la presenza di immunoreattività, che era assente utilizzando sieri privi di AbTPO.
Una debole immunoreattività è stata dimostrata nelle cellule epiteliali carcinomatose mammarie anche tramite immunoistochimica utilizzando un anticorpo monoclonale di topo diretto contro la TPO.
In conclusione in questa tesi si evidenzia come la TPO non sia una proteina enzimatica specifica della tiroide in quanto espressa, anche se a livelli nettamente inferiori rispetto al tessuto tiroideo, anche in altri tessuti, tumorali e non.
In particolare l’espressione del gene della TPO nel tessuto di CM potrebbe determinare una risposta immunitaria comune tra il tessuto tiroideo e il CM, spiegando sia la correlazione epidemiologica tra CM e tireopatie benigne autoimmuni, sia il ruolo protettivo svolto dagli AbTPO nelle pazienti affette da CM. Tale ipotesi rappresenta il punto di partenza di possibili future immunoterapie tumore-specifiche ed inoltre la presenza di isoforme TPO tessuto-specifiche potrebbe essere molto utile nella pratica diagnostica.

SUMMARY (ENGLISH)
The association between benign thyroid diseases and breast cancer (BC) has long been known and women with BC and anti thyroid peroxidase (TPO) autoantibodies (TPOAb) have a better prognosis than women lacking TPOAb. We hypothesize a BC/thyroid shared antigen that provides a target for humoral or cell-mediated immune activity; candidates include the sodium/iodide symporter (NIS, expressed in thyroid and BC), cross-reacting epitopes in TPO and lactoperoxidase (LPO) or TPO itself. Since the association is with TPOAb, we investigated TPO expression in 3 different BC cell lines (MCF-7, T47-D, MDAMB-231), BC tissue, breast peri-tumoral tissue (PT), other tissues (tumoral and not) and thyroid as positive control.
TPO gene undergoes alternative splicing to generate different TPO isoforms lacking one or more exons. Transcripts for known and novel TPO isoforms were detected in BC (n=8) and PT (n=8) but at approximately 104 fold lower than in thyroid while in all the different BC cell lines and in non-BC tumours (n=5) they were at the limit of detection. TPO was expressed also in adipose tissue (n=17), 103 fold lower than in thyroid.
Full length TPO protein (Mr 105-110 kDa) was detected in western blots in the majority of examined cell lines and tissues; pre-absorption of the TPO antibody with recombinant TPO (but not LPO) reduced the signal, indicating specificity. The same occurred with some lower molecular weight bands, which could correspond to smaller TPO transcript isoforms lacking one or more exons, present in all samples.
Sera from women with TPOAb displayed immunoreactivity to BC tissue by immunofluorescence that was not apparent in women without TPOAb.
Using immunohistochemistry a weak TPO immunoreactivity was found in a small proportion of breast epithelium, obtained in 2/2 BC tissues analyzed.
This work shows that TPO is not a thyroid-specific enzyme since expressed, even if at lower levels, in other tissues. In particular TPO expression in neoplastic breast tissue could explain the increased prevalence and positive prognostic factor of serum autoantibodies to TPO in patients with breast cancer, with implications in future studies searching for potential tumor-specific immunotherapies for BC. The identification of tissue-specific TPO isoforms could be also very useful in diagnostic.