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Questo studio mira a generare e caratterizzare organoidi di colangiociti (COs) derivati da biopsie epatiche ottenuti da riceventi di trapianto di fegato. L'obiettivo principale era stabilire un modello in vitro che rappresentasse accuratamente le caratteristiche dei colangiociti, superando le limitazioni delle colture bidimensionali tradizionali, che spesso non riescono a mantenere la differenziazione e la vitalità nel tempo.
Sono stati raccolti campioni di biopsia epatica da 12 riceventi di trapianto di fegato con diverse condizioni epatiche sottostanti, tra cui carcinoma epatocellulare, colangite biliare primitiva, steatoepatite non alcolica e steatoepatite alcolica. Questi campioni sono stati conservati in una soluzione di preservazione a basse temperature per mantenere la vitalità cellulare. I tessuti bioptici sono stati digeriti enzimaticamente con collagenasi per rilasciare singole cellule, successivamente incorporate in Matrigel, una matrice extracellulare tridimensionale. Gli organoidi sono stati coltivati in un terreno di coltura specializzato contenente fattori di crescita chiave come il fattore di crescita dei fibroblasti 10 (FGF10), il fattore di crescita epidermico (EGF), il fattore di crescita degli epatociti (HGF) e R-spondina 1 (RSPO1), che supportano la proliferazione e la differenziazione dei colangiociti. Per valutare la crescita e la stabilità degli organoidi nel tempo, le colture sono state espanse per più passaggi, con campioni crioconservati al quinto passaggio per ulteriori analisi. Gli organoidi sono stati caratterizzati mediante colorazione in immunofluorescenza per confermare l'espressione di marcatori specifici dei colangiociti, come SOX9, KRT7 e KRT19. L'analisi dell'espressione genica mediante RT-qPCR è stata effettuata per valutare i livelli di espressione dei geni associati al tratto biliare, tra cui SOX9, EPCAM, AQP1, CFTR e GGT1, nei passaggi iniziali e tardivi per monitorarne la differenziazione e la stabilità nel tempo.
Dei 12 campioni di biopsia epatica elaborati, cinque hanno generato con successo organoidi di colangiociti vitali che potevano essere espansi e mantenuti fino al quinto passaggio. Questi organoidi hanno mostrato una caratteristica struttura sferoide tridimensionale, con alcuni che sviluppavano formazioni complesse come gemmazioni e strutture simili a dotti, indicative di tessuto biliare funzionale. La colorazione in immunofluorescenza ha confermato l'espressione di marcatori specifici dei colangiociti, con segnali intensi per SOX9, KRT7 e KRT19, validando la loro differenziazione in cellule epiteliali biliari. L'analisi dell'espressione genica ha mostrato un aumento dell'espressione di SOX9 e AQP1 nei passaggi più avanzati, suggerendo una maturazione progressiva degli organoidi nel tempo. I livelli di espressione di EPCAM, CFTR e GGT1 sono rimasti stabili, indicando che i COs hanno mantenuto le loro caratteristiche biliari anche dopo più passaggi. Questi risultati hanno dimostrato che gli organoidi di colangiociti possono essere mantenuti in coltura preservando la loro identità funzionale.
La generazione riuscita di organoidi di colangiociti da campioni di biopsia epatica evidenzia il potenziale di questo approccio come modello in vitro affidabile per lo studio della fisiologia e delle patologie dei dotti biliari. La capacità di mantenere questi organoidi per più passaggi senza perdere le caratteristiche dei colangiociti rappresenta un vantaggio significativo rispetto alle colture cellulari primarie tradizionali, che spesso subiscono un rapido declino funzionale. L'aumento dell'espressione di SOX9 e AQP1 nei passaggi tardivi suggerisce che gli organoidi subiscono una differenziazione e maturazione progressiva, essenziale per modellare accuratamente le funzioni biliari. Poiché SOX9 svolge un ruolo chiave nella proliferazione e differenziazione dei colangiociti, la sua upregolazione indica che gli organoidi mantengono il loro potenziale rigenerativo nel tempo. A differenza delle colture cellulari bidimensionali convenzionali, che non riescono a replicare il complesso microambiente dei dotti biliari, questi organoidi tridimensionali forniscono un modello fisiologico più reale. La possibilità di generare organoidi di colangiociti da pazienti con diverse patologie epatiche apre nuove prospettive per la modellizzazione personalizzata delle malattie. Questi organoidi potrebbero essere utilizzati per studiare specifiche colangiopatie, identificare biomarcatori e testare composti terapeutici in un contesto specifico per il paziente. Tuttavia, rimangono delle sfide nell'ottimizzazione delle condizioni di coltura per migliorare l'efficienza della formazione degli organoidi nei diversi campioni di pazienti. Sono necessarie ulteriori ricerche per perfezionare i protocolli di differenziazione e migliorare la maturità funzionale degli organoidi, ampliando così la loro applicabilità nella medicina traslazionale.
Questo studio ha stabilito con successo un metodo per generare e caratterizzare organoidi di colangiociti da biopsie epatiche. Questi organoidi hanno dimostrato di esprimere marcatori biliari chiave, mantenendo la loro integrità strutturale e funzionale per più passaggi e mostrando una maturazione progressiva. I risultati evidenziano il potenziale degli organoidi di colangiociti come un solido modello in vitro per lo studio delle colangiopatie e per la sperimentazione di nuove terapie. Le ricerche future dovrebbero concentrarsi sull'ottimizzazione delle condizioni di coltura, sull'aumento dell'efficienza nella generazione degli organoidi e sull'esplorazione delle variazioni specifiche del paziente per migliorarne la riproducibilità e la rilevanza clinica.

This study aimed to generate and characterize cholangiocyte organoids (COs) derived from liver biopsy samples obtained from liver transplant recipients. The primary goal was to establish an in vitro model that accurately represents cholangiocyte characteristics, overcoming the limitations of traditional two-dimensional cultures, which often fail to maintain differentiation and viability over time.
Liver biopsy samples were collected from 12 liver transplant recipients with various underlying liver conditions, including hepatocellular carcinoma, primary biliary cholangitis, non-alcoholic steatohepatitis, and alcoholic steatohepatitis. These samples were stored in a preservation solution at low temperatures to maintain cell viability. The biopsy tissues were enzymatically digested using collagenase to release individual cells, which were then embedded in Matrigel, a three-dimensional extracellular matrix scaffold. The organoids were cultured in a specialized medium containing key growth factors such as fibroblast growth factor 10 (FGF10), epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF), and R-spondin 1 (RSPO1), which support cholangiocyte proliferation and differentiation. To evaluate the organoid growth and stability over time, the cultures were expanded over multiple passages, with samples cryopreserved at the fifth passage for further analysis. The organoids were characterized using immunofluorescence staining to confirm the expression of cholangiocyte markers such as SOX9, KRT7, and KRT19. Gene expression analysis using real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was performed to assess the expression levels of biliary-associated genes, including SOX9, EPCAM, AQP1, CFTR, and GGT1, at early and late passages to monitor their differentiation and stability over time.
Of the 12 liver biopsy samples processed, five successfully generated viable cholangiocyte organoids that could be expanded and maintained up to the fifth passage. These organoids displayed a characteristic three-dimensional spheroid structure, with some developing complex features such as budding formations and duct-like architectures, indicative of functional biliary tissue. Immunofluorescence staining confirmed the expression of cholangiocyte-specific markers, with strong signals for SOX9, KRT7, and KRT19, validating their differentiation into biliary epithelial cells. Gene expression analysis showed an increase in SOX9 and AQP1 expression at later passages, suggesting progressive maturation of the organoids over time. The expression levels of EPCAM, CFTR, and GGT1 remained stable, indicating that the COs retained their biliary characteristics even after multiple passages. These findings demonstrated that cholangiocyte organoids could be maintained in culture while preserving their functional identity.
The successful generation of cholangiocyte organoids from liver biopsy samples highlights the potential of this approach as a reliable in vitro model for studying bile duct physiology and pathology. The ability to maintain these organoids over multiple passages without losing cholangiocyte characteristics represents a significant advantage over traditional primary cell cultures, which often experience a rapid decline in function. The increased expression of SOX9 and AQP1 at later passages suggests that the organoids undergo progressive differentiation and maturation, which is crucial for accurately modeling biliary functions. Since SOX9 plays a key role in cholangiocyte proliferation and differentiation, its upregulation indicates that the organoids retain their regenerative potential over time. Unlike conventional two-dimensional cell cultures, which fail to replicate the complex microenvironment of the bile ducts, these three-dimensional organoids provide a more physiologically relevant model. The ability to generate cholangiocyte organoids from patients with different liver diseases opens new possibilities for personalized disease modeling. These organoids could be used to study specific cholangiopathies, identify biomarkers, and test therapeutic compounds in a patient-specific manner. However, challenges remain in optimizing culture conditions to improve organoid formation efficiency across different patient samples. Further research is needed to refine differentiation protocols and enhance the functional maturity of the organoids to expand their applicability in translational medicine.
This study successfully established a method for generating and characterizing cholangiocyte organoids from liver transplant biopsies. These organoids demonstrated key biliary markers, maintained their structural and functional integrity over multiple passages, and showed progressive maturation. The findings highlight the potential of cholangiocyte organoids as a robust in vitro model for studying cholangiopathies and testing new therapeutic approaches. Future research should focus on optimizing culture conditions, increasing the efficiency of organoid generation, and exploring patient-specific variations to enhance their reproducibility and clinical relevance.