• angiogenesi
• Apigenina
• flavonoidi
• infiammazione
• inflammation
• pathologic angiogenesis
• polifenoli
• tnf-alfa

RIASSUNTO
L'angiogenesi consiste nella formazione di nuovi vasi sanguigni da un letto vascolare pre-esistente ed è di fondamentale importanza in alcuni processi fisiologici. In queste condizioni la genesi di nuovi capillari è regolata accuratamente ed i nuovi vasi sanguigni maturano velocemente e diventano stabili.
Tuttavia, se compromessa, l'angiogenesi può rappresentare l'evento chiave di vari stati patologici.
Un'eccessiva presenza di citochine infiammatorie innesca la proliferazione delle cellule endoteliali che culmina nell'angiogenesi caratteristica dei tumori. Diversi studi clinici hanno riportato livelli elevati di citochine circolanti nei pazienti oncologici e questi risultati supportano il concetto di promozione di terapie antinfiammatorie al fine di contrastare la progressione del cancro. Tra i prodotti genici proinfiammatori che caratterizzano l'ambiente del cancro vi sono il fattore di necrosi tumorale (TNF-α), l'interleuchina-6, i fattori di crescita endoteliali, le metalloproteasi, le molecole di adesione e le chemochine, la cui espressione è principalmente regolata dal fattore nucleare di trascrizione NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), che svolge un ruolo chiave sia nel controllo dell'infiammazione che nello sviluppo del tumore. Il TNF-α induce l'espressione genica nelle cellule endoteliali ed è angiogenico in vivo. Sebbene in vitro non scateni direttamente la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali, la sua azione angiogenica è stimolata dalla produzione di induttori angiogenici diretti o di proteasi.

La natura degli effetti del TNF-α dipende principalmente dalla concentrazione della citochina. Nell'ambito dell'angiogenesi, è stato dimostrato che concentrazioni più basse di TNF-α stimolano la proliferazione e la migrazione attraverso il recettore TNFR2, mentre concentrazioni più alte di TNF-α inibiscono entrambe queste risposte attraverso il TNFR1.
Le vie di trasduzione attivate in seguito al legame del TNF-α ai recettori coinvolge la via delle (MAP) chinasi (Mitogen-Activated Protein Kinase), che include ERK (extracellular-signal-regulatedkinases); JNK (cJun NH2-terminal kinases) e p38 ed inoltre determina l'attivazione dei principali fattori di trascrizione cellulari quali NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), STAT 3 (Signal transducer and activator of transcription 3), STAT 5 (Signal transducer and activator of transcription 5) e CREB (cAMP response element-binding protein).
Vi sono delle sostanze naturalmente presenti negli alimenti e che giornalmente dovrebbero essere introdotte con la dieta che sono in grado di esplicare i loro effetti benefici sulla salute andando ad agire sulle vie di trasduzione del segnale che mediano le funzioni cellulari. Tra queste sostanze rientrano i polifenoli presenti maggiormente in alimenti quali verdure, frutta, cereali e legumi secchi, cioccolato, olive, olio extravergine d’oliva, tè, vino e caffè, che hanno dimostrato di possedere una significativa attività anti-angiogenica e anti-infiammatoria.
Nonostante i polifenoli siano dotati di attività interessanti, i loro effetti sono stati valutati a concentrazioni alte e non fisiologiche, raramente raggiungibili in circolo. Inoltre, la loro bassa solubilità e stabilità, associata a proprietà farmacocinetiche sfavorevoli, e la capacità di agire su diversi bersagli molecolari e fra loro indipendenti, limitano sensibilmente il loro sfruttamento come integratori alimentari o come potenziali farmaci. Tuttavia, essi rappresentano una logica ed eccellente fonte di ispirazione per la chimica farmaceutica, in quanto partendo dalla loro struttura chimica si possono progettare analoghi sintetici che siano più specifici e più efficaci a basse concentrazioni.

Scopo.
Studiare gli effetti in vitro di un analogo sintetico del flavone apigenina, il 2-(3,4-dimetossifenil)-3-fenil-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-one (chiamato DB103), sulla modulazione delle vie di trasduzione del segnale, indotte dalla citochina TNF-α,coinvolte nell'angiogenesi: le MAP chinasi (Mitogen-Activated Protein Kinase) − tra cui la famiglia delle ERKs (Extracellular signal–Regulated Kinases), la famiglia delle chinasi JNK (c-Jun N-terminal Kinases), la p38 (p38 mitogen-activated protein kinases) − ed i fattori di trascrizione NF-kB (Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells ), STAT 3 (Signal transducer and activator of transcription 3) e STAT 5 (Signaltransducer and activator of transcription 5) e CREB (cAMP response element-binding protein), a valle di queste chinasi.

Metodi.
Il DB103 è stato sintetizzato presso il Dipartimento di Farmacia (brevetto: MI20120514). Il mio lavoro di tesi si è svolto presso l’Istituto di Fisiologia Clinica del CNR e si è inserito nell’ambito del progetto di ricerca “MICRO systems for VAScular diagnostics and inTervention” (MICRO-VAST), finanziato dalla Fondazione Pisa e a cui hanno collaborato diversi partners − fra cui il gruppo del Dipartimento di Farmacia che si è occupato della sintesi di nuovi agenti terapeutici vascolari − ed il gruppo di biologi dell’Istituto di Fisiologia Clinica che ne ha valutato l’efficacia.
Per eseguire tutti gli esperimenti di questo studio sono state utilizzate cellule endoteliali umane ottenute da vene di cordone ombelicale. Poiché il composto DB103 è strutturalmente correlato ai flavonoidi, abbiamo valutato la sua efficacia mettendolo a confronto con il flavone apigenina. E’ stato utilizzato il TNF-α come stimolo infiammatorio a 10 ng/mL per 10 minuti, in costimolazione con DB103 (10µmol/L e 50 µmol/L) oppure con l’apigenina (10µmol/L).
L’attivazione delle chinasi ed i fattori di trascrizione sono stati valutati sui lisati cellulari,eseguiti dopo 10 minuti di stimolazione,con il kit MILLIPLEX MAP human multi-pathway -plex magnetic bead signalling phosphoprotein (Merck Millipore, Billerica, MA) che si basa su una tecnologia che fa uso di microsfere magnetiche che permettono dosaggi sia in singolo che multipli. Con questa tecnica abbiamo valutato i cambiamenti di fosforilazione delle ERK/MAP kinasi 1/2 (Thr185/Tyr187), JNK (Thr183/Tyr185), p38 (Thr180/Tyr182), e quella dei fattori di trascrizione STAT3 (Ser727), STAT5 (Tyr694/699) e CREB (Ser133). I livelli di fosforilazione della subunità p65 di NF-kB furono invece misurati utilizzando il PathScan® Phospho-NF-kB p65 (Ser536) Sandwich ELISA Kit (Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA).
Dopo 10 minuti di stimolazione, il TNF-α a 10 ng/mLattivava JNK, p38 ed ERK/MAP kinase ½.