• apoptosi
• dispositivi di assistenza ventricolare
• scompenso cardiaco

Riassunto
Introduzione. Lo scompenso cardiaco (SC) è la malattia cardiovascolare con il più elevato impatto socio-sanitario ed è caratterizzato da un’alterazione della funzione cardiaca dovuta a perdita di cardiomiociti funzionanti con conseguente riduzione dell’attività contrattile e incapacità da parte del cuore di garantire una portata adeguata alle esigenze metaboliche dell’organismo. Fra i meccanismi molecolari alla base del progressivo deterioramento della funzione del miocardio (noti complessivamente come rimodellamento cardiaco), il processo apoptotico del cardiomiocita sembra avere un ruolo centrale. Recentemente è stato postulato che nello SC l’apoptosi del cardiomiocita possa essere un processo reversibile e modulabile con opportuni trattamenti terapeutici, fra cui rivestono grande rilevanza i dispositivi di assistenza ventricolare (LVAD).
Scopo. Questo lavoro di tesi si propone di valutare se l’impianto di LVAD in pazienti con SC grave è in grado di interferire con il processo apoptotico, misurando l’espressione, sia a livello di mRNA che di proteina, di effettori pro- e anti-apoptotici in biopsie di tessuto cardiaco ottenute da pazienti sottoposti a impianto di LVAD e da pazienti con SC di pari gravità senza impianto di LVAD.
Metodi. Grazie alla collaborazione con IFC-CNR e l’Ospedale Niguarda di Milano, sono stati studiati pazienti con SC in fase terminale sottoposti a impianto di LVAD come ponte al trapianto (LVAD) (n=6, classe NYHA III-IV; età 45±2 anni; LVEF%: 24±4) e pazienti con SC di pari gravità sottoposti a trapianto d’organo senza impianto di LVAD, come gruppo di controllo (CTx) (n=6; classe NYHA III-IV; età 53±4 anni; LVEF%: 25±2). Biopsie cardiache sono state ottenute al momento dell’impianto del LVAD (apice) nei pazienti LVAD e all’espianto cardiaco (da varie regioni del ventricolo destro e sinistro) sia negli LVAD che nei CTx. RNA e proteine totali sono state estratte simultaneamente dagli stessi campioni con il metodo del fenolo/cloroformio/guanidina-tiocianato. L’espressione a livello di mRNA di marcatori pro-apoptotici (Bax, Bid, Casp-9, Casp-3, Casp-8) e anti-apoptotici (Hsp72 e Bcl-2) è stata valutata tramite analisi RT-PCR semiquantitativa (gene di riferimento eEF1A). L’espressione a livello di proteina è stata valutata attraverso analisi Western Blot semiquantitativa. L’integrità del DNA è stata valutata tramite DNA Laddering mentre la localizzazione tissutale e cellulo-specifica di Bcl-2 è stata valutata con tecniche di immunoistochimica.
Risultati. A livello di mRNA, è stato osservata una diminuzione dell’espressione di Casp-9 e Bax e un aumento di Hsp72 e Bcl-2 nel ventricolo sinistro degli LVAD rispetto ai CTx; nel ventricolo destro l’espressione di Bcl-2 è risultata aumentata significativamente negli LVAD rispetto ai CTx (2.88±0.74 vs 1.13±0.42, p=0.02). Non si sono osservate variazioni per Casp-3, Casp-9, Hsp72 e Bax mentre l’espressione di Casp-8 è diminuita in entrambi i ventricoli dei pazienti LVAD rispetto ai CTx. Per quanto riguarda le proteine, è stato osservato un aumento significativo di Hsp72 negli LVAD rispetto ai CTx, sia nel ventricolo sinistro (4.21±0.63 vs 2.79±0.29 µg/mg proteina p=0.048) che nel ventricolo destro (5.24±0.62 vs 1.97±0.18 µg/mg proteina p<0.001). E’ stata osservata una diminuzione della Casp-9 nel ventricolo sinistro nei pazienti LVAD rispetto ai CTx (1,34±0,077 vs 1,53±0,13 µg/mg proteina).
Conclusioni. La ridotta espressione di fattori pro-apoptotici e l’aumento di quella dei sistemi di controllo dell’apoptosi, osservate nel corso di questo lavoro di tesi, nei pazienti LVAD rispetto ai CTx, indicano che i dispositivi di assistenza ventricolare sono in grado di modulare positivamente il processo apoptotico nel tessuto cardiaco di pazienti con SC grave. Questa osservazione suggerisce che l’impianto di LVAD, interferendo favorevolmente con i meccanismi molecolari coinvolti nel processo di rimodellamento cardiaco, possa rendere possibile il recupero del cuore naturale, una volta messo a riposo con l’ausilio del LVAD, come recentemente ipotizzato sulla base di dati emodinamici, clinici e funzionali.

Abstract
Introduction. Heart Failure (HF) is a condition mainly characterized by the heart inability to pump blood efficiently to the tissues and organs. Among the many molecular mechanisms underlying the progressive deterioration of myocardial function (known complexively as cardiac remodeling), the cardiomyocyte apoptosis seems to play a central role, leading to a substantial reduction of the number of contractile cardiomyocyte and causing deleterious effects on cardiac chamber geometry and function. Recently, it has been hypotized that the cardiomyocyte apoptosis in HF may be a reversible process that can be positively modulated by target therapeutic treatments, including the Left Ventricular Assist Device (LVAD) implantation.
Aim. To evaluate if LVAD implantation, in end-stage HF patients is associated to positive variations of the cardiac apoptotic process, by measuring the belance between pro- and anti-apoptotic markers in cardiac tissues obtained from patients undergoing LVAD implantation as a bridge to transplantation compared to patients submitted directly to organ transplantation.
Methods. Patients undergone to LVAD implantation as a bridge to transplantation (LVAD, n= 6, NYHA class III-IV, age 45±2 years; LVEF% : 24±4) and end-stage HF submitted to heart transplantation (CTx, n= 7; NYHA class III-IV, age 53±4 years, LVEF%: 25±2) were enrolled at IFC-CNR-Niguarda Hospital, Milan. Cardiac biopsies were obtained at LVAD implantation (apex) in LVAD and at cardiac transplantation (from different regions of left and right ventricles) in both LVAD and CTx groups. The pro-apoptotic indices analyzed were: Caspase (Casp)-9, Casp-8, Casp-3, Bax and Bid; the Hsp72 and Bcl-2 were studies as apoptosis control system. Total RNA and proteins are simultaneously extracted from the same samples by the method Phenol/Chloroform/Guanidine-Thiocyanate. Biomarker mRNA expression was determined by semi-quantitative RT-PCR (reference gene eEF1A); protein concentration was evaluated by Western Blot analysis (the normalization was performed by dose-response curve for Hsp72 and Casp-9, or using GAPDH). DNA laddering and histological evaluation were also performed.
Results. In the left ventricle of LVAD, the mRNA expression of pro-apoptotic Casp-9 and Bax was lower compared to CTx while that of Hsp72 and Bcl-2 was higher. In the right ventricle the mRNA expression of anti-apoptotic Bcl-2 was significantly higher in LVAD than in Ctx (2.88 ± 0.74 vs 1.13 ± 0.42, p=0.02). No differences for Casp-3, Casp-9, Hsp72 and Bax were found between the two groups in right ventricle whereas the mRNA expression of Casp-8 decreased in both ventricles of LVAD compared to CTx. At protein level, Hsp72 was significantly higher in LVAD than in CTx patients (left ventricle 4.21 ± 0.63 vs 2.79 ± 0.29 µg/mg protein p=0.048; right ventricle 5.24 ± 0.62 vs 1.97 ± 0.18 µg/mg protein p<0.001). In the left ventricle, a decrease of Casp-9 was also observed in LVAD patients compared to CTx (1,34 ± 0,077 vs 1,53 ± 0,13 µg/mg protein p=ns).
Conclusion. A reduced expression of pro-apoptotic factors associated with an increase of anti-apoptotic markers was observed in LVAD patients compared to CTx. Our findings indicate that the LVAD implantation is able to modulate the apoptotic process in cardiac tissue of patients with end-stage HF. This observation is in tune with previously findings showing that LVAD can interfere with some molecular mechanisms of cardiac remodeling and it suggests that LVAD implantation could contribute to the recovery of the natural heart.