ETD

• contaminanti emergenti
• molluschi bivalvi
• Mytilus galloprovincialis
• nimesulide
• One Health

The continuous release of pharmaceutical residues into aquatic ecosystems, including non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as nimesulide (NIM), has become a priority in ecotoxicological research. Recent studies have classified NIM as a pseudo-persistent emerging contaminant because, although it is subject to transformation and removal processes, its continuous input through urban, hospital, and livestock effluents results in its near-constant presence in aquatic environments, thereby maintaining environmentally relevant and biologically active concentrations. This raises particular concern regarding its potential sublethal effects on non-target organisms, especially through alterations in physiological, metabolic, and oxidative processes, as well as its possible transfer along the trophic chain. This thesis investigated the bioaccumulation dynamics of NIM, a preferential cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor, in the bivalve mollusc Mytilus galloprovincialis, a model species and bioindicator widely used in marine contamination monitoring. The experimental work was carried out in collaboration with the University of Aveiro (Portugal), which was responsible for the exposure trials and the biochemical and histological analyses. Mussels were exposed for 28 days to nominal environmentally relevant concentrations of NIM (0.5, 2.5, and 12.5 µg/L) under controlled conditions. The focus of this thesis was the determination and quantification of NIM in tissues, together with the assessment of its persistence in the aqueous phase. To this end, analytical protocol based on solid-phase extraction (SPE) followed by HPLC-UV analysis (high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection) was optimised and validated. Validation in tissue included recovery assays at five spiking levels (0.01, 0.1, 0.5, 1, and 10 ppm), with recoveries ranging from 88.8% to 112.9%. Method sensitivity, expressed on a dry weight (DW) basis, showed a limit of detection (LOD) of 0.25 ppm (µg/g DW) and a limit of quantification (LOQ) of 0.5 ppm DW. After 28 days of exposure, NIM was quantifiable in tissue only at the nominal concentration of 12.5 µg/L, with values ranging from 0.82 to 1.29 µg/g DW and a mean concentration of 1.02 ± 0.17 µg/g DW. At the 2.5 and 0.5 µg/L exposure levels, tissue concentrations remained below the LOQ and were therefore not quantifiable. In the aqueous phase, a reduction in NIM concentration was observed after one week in the presence of the organisms. Specifically, at the nominal concentration of 12.5 µg/L, the mean concentration decreased from 15.36 ± 4.25 µg/L, measured before organism exposure, to 11.06 ± 0.14 µg/L after one week. Similarly, at the nominal concentration of 2.5 µg/L, the mean value declined from 1.93 ± 0.11 µg/L to 1.46 ± 0.06 µg/L, again confirming a decrease in analyte concentration in the aqueous medium. Overall, the results demonstrate the bioavailability of NIM and its potential for bioaccumulation in M. galloprovincialis, highlighting the need to incorporate pharmaceutical residues into environmental monitoring programmes and food quality management systems, in line with the One Health approach.

Il rilascio continuo di residui farmaceutici negli ecosistemi acquatici, inclusi farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) quali la nimesulide (NIM), rappresenta una priorità per la ricerca ecotossicologica. Studi recenti hanno classificato la NIM come contaminante emergente pseudo-persistente, in quanto, pur essendo soggetta a processi di trasformazione e rimozione, il suo rilascio continuo attraverso gli effluenti urbani, ospedalieri e zootecnici ne determina una presenza pressoché costante nei corpi idrici, mantenendone la concentrazione ambientale a livelli biologicamente rilevanti. Tale condizione desta particolare preoccupazione per i potenziali effetti sub-letali sugli organismi non bersaglio, soprattutto in relazione ad alterazioni dei processi fisiologici, metabolici e ossidativi, nonché per il possibile trasferimento lungo la catena trofica. Oggetto della presente tesi è stata la determinazione e quantificazione della NIM nei tessuti e la valutazione della sua persistenza nella fase acquosa.
Le dinamiche di bioaccumulo della NIM, inibitore preferenziale della ciclossigenasi-2 (COX-2), sono state valutate nel mollusco bivalve Mytilus galloprovincialis, specie modello e bioindicatore impiegato nel monitoraggio dei contaminanti in ambiente marino. Le attività sperimentali sono state svolte in collaborazione con l’Università di Aveiro (Portogallo), responsabile della fase di esposizione e delle analisi biochimiche ed istologiche. I mitili sono stati esposti per 28 giorni a concentrazioni nominali ambientalmente rilevanti di NIM (0.5, 2.5, 12.5 µg/L) in condizioni controllate.
In particolare è stato ottimizzato e validato un protocollo analitico basato su estrazione in fase solida (SPE) seguita da analisi in HPLC-UV (cromatografia liquida ad alte prestazioni con rilevatore ultravioletto), impostato a 298 nm per entrambe le matrici, secondo Mezzelani et al. (2016). La validazione nel tessuto ha incluso prove di recupero a cinque livelli di spike (0.01, 0.1, 0.5, 1, 10 ppm), con recuperi compresi tra 88.8% e 112.9%. La sensibilità del metodo, espressa su base di peso secco (DW), ha evidenziato un limite di rilevabilità (LOD) pari a 0.25 ppm (µg/g DW) e un limite di quantificazione (LOQ) pari a 0.5 ppm. Dopo 28 giorni di esposizione, la NIM è risultata quantificabile nel tessuto solo alla concentrazione nominale di 12.5 µg/L, con valori compresi tra 0.82 e 1.29 µg/g DW e una concentrazione media pari a 1.02 ± 0.17 µg/g DW. Alle esposizioni di 2.5 e 0.5 µg/L, le concentrazioni tissutali sono risultate inferiori al LOQ e pertanto non quantificabili.
Nella fase acquosa è stata osservata una riduzione della concentrazione di NIM dopo una settimana di permanenza degli organismi. In particolare, alla concentrazione nominale di 12.5 µg/L, la concentrazione media è diminuita da 15.36 ± 4.25 µg/L, misurata prima dell’esposizione degli organismi, a 11.06 ± 0.14 µg/L dopo una settimana. Analogamente, alla concentrazione nominale di 2.5 µg/L, il valore medio si è ridotto da 1.93 ± 0.11 µg/L a 1.46 ± 0.06 µg/L, confermando anche in questo caso una diminuzione della concentrazione dell’analita nel mezzo acquoso.
Nel complesso, i risultati indicano la biodisponibilità della NIM e la possibilità di bioaccumulo in M. galloprovincialis, sottolineando la necessità di integrare i residui farmaceutici nei piani di monitoraggio ambientale e nei sistemi di gestione della qualità alimentare, in coerenza con l’approccio One Health.