ETD

• chemoresistance
• FOLFIRINOX
• lipidomics
• organ-on-chip
• pdac
• proteomics
• tumoroids

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly lethal malignancy often diagnosed at an advanced stage, where the development of resistance to standard multi-drug regimens like FOLFIRINOX severely limits clinical efficacy. This thesis investigates the metabolic, lipidomic, and proteomic mechanisms underlying FOLFIRINOX resistance in two PDAC cell lines, MIA PaCa-2 and PANC-1, by comparing their responses in traditional two-dimensional (2D) monolayers and three-dimensional (3D) tumoroids to understand the influence of spatial architecture on therapy resistance. Cells were continuously exposed to FOLFIRINOX to generate early drug-adapted populations at an IC30 concentration. A multi-omics approach was employed, utilizing targeted lipidomic analysis via HPLC-MS/MS and untargeted proteomic analysis via LC-MS. The results revealed that PDAC cells do not rely on a single, universal resistance mechanism but deploy distinct, cell-specific survival strategies. In 2D cultures, resistant MIA PaCa-2 cells demonstrated significant membrane remodeling, shifting towards saturated fatty acids (SFA) and long-chain phosphatidylcholines, which likely reduces membrane permeability and creates a physical barrier against drug entry. Concurrently, their proteomic profile showed a massive downregulation of pathways related to translation, RNA processing, and mitochondrial function, suggesting the cells enter a quiescent-like, energy-saving "Drug-Tolerant Persister" (DTP) state to survive chemotherapeutic stress. Interestingly, MIA PaCa-2 tumoroids grown for 7 days without the drug showed no significant lipidomic divergence from controls, indicating that the DTP state is highly transient and reversible upon drug withdrawal. Conversely, PANC-1 cells exhibited a completely different survival strategy under drug pressure. Instead of accumulating vulnerable lipids in the membrane, they actively sequestered polyunsaturated fatty acids (PUFAs) into internal neutral storage pools like cholesteryl esters, likely to protect themselves from lipid peroxidation and oxidative stress. Furthermore, the PANC-1 proteome remained remarkably stable, suggesting their resistance relies on alternative regulatory mechanisms rather than large-scale changes in protein abundance. Parallel to these omics investigations, the study laid the groundwork for a vascularized microfluidic "organ-on-chip" platform by designing a polydimethylsiloxane (PDMS) device incorporating an electrospun gelatin nanofiber membrane. While the device was successfully fabricated, preliminary cell seeding on the membranes faced technical challenges, such as trapped air bubbles and poor cell adhesion, highlighting the need for further methodological optimization. Ultimately, the integration of these multi-omics insights with advanced 3D and microfluidic models represents a crucial step toward better understanding and overcoming therapy resistance in pancreatic cancer.

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una neoplasia altamente letale, spesso diagnosticata in uno stadio avanzato in cui lo sviluppo di resistenza a regimi standard multifarmaco come il FOLFIRINOX ne limita gravemente l'efficacia clinica. Questa tesi indaga i meccanismi metabolici, lipidomici e proteomici alla base della resistenza al FOLFIRINOX in due linee cellulari di PDAC, MIA PaCa-2 e PANC-1, confrontando le loro risposte nelle tradizionali colture bidimensionali (2D) a monostrato e nei tumoroidi tridimensionali (3D) per comprendere l'influenza dell'architettura spaziale sulla resistenza alla terapia. Le cellule sono state esposte continuamente al FOLFIRINOX per generare popolazioni precocemente adattate al farmaco a una concentrazione IC30. È stato impiegato un approccio multi-omico, utilizzando un'analisi lipidomica mirata tramite HPLC-MS/MS e un'analisi proteomica non mirata tramite LC-MS. I risultati hanno rivelato che le cellule di PDAC non si affidano a un unico meccanismo di resistenza universale, ma mettono in atto strategie di sopravvivenza distinte e specifiche per ogni linea cellulare. Nelle colture 2D, le cellule MIA PaCa-2 resistenti hanno mostrato un significativo rimodellamento della membrana, spostandosi verso acidi grassi saturi (SFA) e fosfatidilcoline a catena lunga, il che riduce probabilmente la permeabilità della membrana e crea una barriera fisica contro l'ingresso del farmaco. Contemporaneamente, il loro profilo proteomico ha mostrato una massiccia sottoregolazione dei percorsi legati alla traduzione, all'elaborazione dell'RNA e alla funzione mitocondriale, suggerendo che le cellule entrino in uno stato di quiescenza a risparmio energetico, noto come "Drug-Tolerant Persister" (DTP), per sopravvivere allo stress chemioterapico. È interessante notare che i tumoroidi MIA PaCa-2 cresciuti per 7 giorni senza il farmaco non hanno mostrato alcuna divergenza lipidomica significativa rispetto ai controlli, indicando che lo stato DTP è altamente transitorio e reversibile alla sospensione del farmaco. Al contrario, le cellule PANC-1 hanno esibito una strategia di sopravvivenza completamente diversa sotto la pressione del farmaco. Invece di accumulare lipidi vulnerabili nella membrana, hanno sequestrato attivamente gli acidi grassi polinsaturi (PUFA) in pool di stoccaggio neutri interni come gli esteri del colesterolo, probabilmente per proteggersi dalla perossidazione lipidica e dallo stress ossidativo. Inoltre, il proteoma di PANC-1 è rimasto notevolmente stabile, suggerendo che la loro resistenza si basi su meccanismi regolatori alternativi piuttosto che su cambiamenti su larga scala nell'abbondanza delle proteine. Parallelamente a queste indagini omiche, lo studio ha gettato le basi per una piattaforma microfluidica vascolarizzata "organ-on-chip" progettando un dispositivo in polidimetilsilossano (PDMS) che incorpora una membrana in nanofibre di gelatina elettrofilata. Sebbene il dispositivo sia stato fabbricato con successo, la semina cellulare preliminare sulle membrane ha incontrato sfide tecniche, come bolle d'aria intrappolate e scarsa adesione cellulare, evidenziando la necessità di un'ulteriore ottimizzazione metodologica. In definitiva, l'integrazione di queste intuizioni multi-omiche con modelli avanzati 3D e microfluidici rappresenta un passo cruciale verso una migliore comprensione e il superamento della resistenza alla terapia nel cancro al pancreas.