ETD

• diagnosi
• diagnosis
• Fn3
• mesotelina
• mesotelioma
• mesothelin
• mesothelioma
• terapia
• therapy

Il progetto di tesi è incentrato sul mesotelioma pleurico (MP), un tumore aggressivo che origina dalle cellule mesoteliali della pleura ed è associato all’esposizione all’amianto. Il MP è caratterizzato da una prognosi sfavorevole a causa della scarsa efficacia delle terapie convenzionali.  Tra i bersagli molecolari di interesse per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche, è stata studiata la mesotelina (MSLN), una proteina di membrana altamente espressa nelle cellule di MP e scarsamente presente nei tessuti sani. La possibilità di sviluppare terapie mirate che riconoscano selettivamente la MSLN rappresenta un approccio promettente per il trattamento di questa patologia. A tale fine, in collaborazione con la Prof. Sarah J. Moore (Smith College, MA, USA), è stata ingegnerizzata una variante di Fn3 (Fn3 5.3.2) in grado di legare la MSLN con elevata affinità (costante di dissociazione all’equilibrio, KD ~ 10 nM). Inoltre, per ottimizzare l’efficacia come agente terapeutico e trasportatore di radionuclidi, alla sequenza di Fn3 5.3.2 è stata introdotta una cisteina (Fn3cys) per funzionalizzare Fn3cys con DOTAGA-maleimide e Gallio-69 (69Ga).
Valutazioni computazionali effettuate da collaboratori dell’Università di Palermo hanno, inoltre, permesso di predire mutazioni sulla sequenza di Fn3 5.3.2 in grado di aumentarne l’affinità per la MSLN. L’obiettivo della presente tesi è quello di valutare in vitro se le mutazioni predette aumentano l’affinità di legame Fn3/MSLN. In particolare, è stata studiata una variante di Fn3, ottenuta tramite mutagenesi sito-specifica a partire dal plasmide pEThk Fn3 5.3.2 e successivamente espressa in cellule di E. coli BL21 e purificata tramite cromatografia per affinità. L’affinità della nuova variante per la MSLN è stata valutata tramite citofluorimetria a flusso incubando cellule caratterizzate da un’alta espressione di MSLN con concentrazioni crescenti di Fn3. Una volta effettuato il saggio di legame, sono stati analizzati i dati ed è stata stimata la KD~105 nM, che risulta essere maggiore rispetto alla variante di partenza (Fn3 5.3.2), indicando una minor affinità di legame per MSLN. Inoltre, attraverso Thermal Shift Assay (TSA) la stabilità termica di Fn3 5.3.2, della nuova variante ottenuta e di Fn3cys è stata analizzata a diversi pH. Considerando che la nuova variante ha mostrato un’affinità ridotta per MSLN rispetto alle altre varianti precedenti, per valutare Fn3 come agente teranostico è stata utilizzata la variante Fn3Cys. La proteina è stata coniugata con DOTAGA-maleimide e complessata con 175Lu a temperatura e pH differenti al fine di valutare l’efficacia di funzionalizzazione. L’analisi del complesso ottenuto è stata effettuata mediante spettrometria di massa. Dalle analisi effettuate è stato osservato che la complessazione di DOTAGA-175Lu (10 min, 95°C) con successiva coniugazione con Fn3 (1h, 50°C) risulta essere la condizione ottimale (80% Fn3 funzionalizzata con DOTAGA-175Lu). Questa strategia permette di diminuire il rapporto molare di Fn3-DOTAGA e, di conseguenza, la quantità di 175Lu necessaria al fine di ottenere il complesso Fn3-DOTAGA-175Lu, rendendolo un potenziale agente teranostico per applicazioni mirate contro la MSLN