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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-03232015-113637


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
PINO, LAURA
URN
etd-03232015-113637
Titolo
Progettazione, sintesi e caratterizzazione cinetica in vitro di ribozimi hammerhead contro l'RNA messaggero codificante per BIRC5 (survivina)
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI E INDUSTRIALI
Relatori
relatore Dott.ssa Tedeschi, Lorena
Parole chiave
  • BIRC5
  • knock-down genico
  • ribozimi hammerhead
  • survivina
Data inizio appello
13/04/2015
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
13/04/2085
Riassunto
I ribozimi sono molecole di RNA a singolo filamento dotate di attività catalitica che promuovono la scissione di legami fosfodiesterici presenti sulla propria o su altre molecole di RNA. Di specifico interesse sono i ribozimi hammerhead, piccoli RNA dotati di attività catalitica in trans capaci di riconoscere, legare e scindere selettivamente un RNA di cui si voglia ottenere l’inibizione. La possibilità di progettare ribozimi in grado di esplicare la propria attività endonucleasica contro specifici RNA e la possibilità di ottenerli per sintesi chimica li rende adatti come potenziali strumenti molecolari di knock-down genico.
Questo lavoro di tesi si propone di mettere a punto una strategia di knock-down genico che coinvolge l’uso di ribozimi come strumenti per la modulazione dell’espressione genica. Il bersaglio terapeutico scelto è l’RNA messaggero del gene umano BIRC5 (bacuroviral inhibitor of apoptosis repeat containing 5), sovraespresso nei tumori umani più comuni.
L’attività sperimentale si articola in varie fasi che comprendono la progettazione di ribozimi, la loro sintesi, purificazione e caratterizzazione delle proprietà catalitiche in vitro mediante analisi HPLC.
Utilizzando un sistema bioinformatico, è stata progettata la sequenza del ribozima hammerhead minimal diretto contro l’mRNA di BIRC5. Inoltre, al fine di migliorare l’attività catalitica, sono stati progettati anche i ribozimi extended e XL, caratterizzati dall’aggiunta di una piccola porzione all’estremità 5’ della sequenza oligonucleotidica del ribozima minimal. Studi precedenti, infatti, hanno evidenziato che aggiungendo una particolare sequenza oligonucleotidica all’estremità 5’ del ribozima può essere migliorata l’attività catalitica.
La sintesi dei ribozimi e della rispettiva sequenza bersaglio è stata effettuata mediante l’uso di un sintetizzatore di oligonucleotidi che esegue cicli di sintesi in maniera automatica sfruttando la chimica delle fosforammiditi. Al termine della sintesi, le sequenze sono state recuperate dal supporto solido sul quale è avvenuta la sintesi, deprotette e purificate. I prodotti purificati sono stati quantificati mediante misure di assorbimento UV a 260 nm e successivamente i ribozimi sono stati caratterizzati dal punto di vista catalitico, attraverso misure cinetiche della reazione di scissione effettuata sulla molecola bersaglio. L’analisi delle proprietà cinetiche è stata realizzata utilizzando un metodo cromatografico, che permette di separare il substrato dai prodotti di cleavage mediante HPLC a scambio anionico. Durante questi studi sono state modificate le concentrazioni e i rapporti tra ribozima e target e la concentrazione di ioni magnesio all’interno del tampone di reazione, in quanto questo catione presenta un ruolo importante nell’attività del ribozima permettendogli di ripiegarsi nella giusta conformazione per svolgere la sua attività. La valutazione dell’attività catalitica a concentrazioni di Mg2+ analoghe a quelle intracellulari può essere cruciale per caratterizzare e comparare i diversi ribozimi in condizioni simili a quelle che si riscontrano nell’ambiente biologico, in cui si troverebbero a operare se somministrati come farmaci molecolari per il knock-down genico.
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