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La gamma-glutammiltransferasi (GGT) è un enzima localizzato sulla membrana plasmatica della maggior parte delle cellule e catalizza il primo passaggio del processo di degradazione del glutatione. In condizioni fisiologiche l’enzima è presente preferenzialmente a livello di tessuti epiteliali implicati in attività secretorie e di assorbimento, sebbene mostri una notevole eterogeneità di espressione sia spaziale che temporale. La GGT presente nel siero si pensa sia di origine epatica, anche se non è escluso che altri organi/tessuti possano contribuire. L’enzima GGT è presente anche nella maggior parte dei leucociti e delle piastrine ed è localizzato sia a livello della membrana plasmatica sia nei granuli di secrezione.
Lo scopo della tesi è quello di estrarre e purificare l’enzima GGT da piastrine di origine umana e di confrontare le sue proprietà chimico fisiche con quelle della GGT di origine plasmatica per evidenziarne le caratteristiche specifiche e distintive.
Inizialmente è stato necessario individuare una metodica che consentisse di isolare le piastrine dal resto delle componenti plasmatiche senza indurre aggregazione e attivazione, processi che determinerebbero la degranulazione delle piastrine con conseguente rilascio nell’ambiente extracellulare del materiale contenuto nei granuli piastrinici, tra cui l’enzima GGT di interesse.
L’attività totale di GGT nelle piastrine isolate è stata quantificata utilizzando un substrato cromogeno specifico per l’enzima, gamma-glutammil-p-nitroanilide; la GGT agisce su tale substrato scindendo il legame gamma-glutammilico e liberando paranitroanilina, che presenta un picco massimo di assorbimento a 405 nm.
Dopo aver individuato l’espressione dell’ enzima a livello delle piastrine si è indagato sulle sue caratteristiche chimico fisiche; è stato inoltre operato un confronto tra la GGT sierica e quella piastrinica. La metodica utilizzata per la caratterizzazione della GGT è la cromatografia ad esclusione molecolare. La cromatografia è un processo di analisi che si utilizza per separare sostanze aventi elevato peso molecolare, soprattutto proteine e macromolecole. Alla base di questa separazione vi è una fase stazionaria, costituita da un supporto inerte con pori di dimensioni controllate, e una fase mobile, che consiste in un solvente organico o acquoso che eluisce i soluti attraverso la colonna. Sarà inoltre di supporto allo studio anche la cromatografia a scambio anionico, tecnica che prevede la separazione delle proteine in base alla carica posseduta. La carica della proteina GGT dipende dal contenuto in acido sialico che è noto essere tessuto specifico.