• CB2
• composti dualsterici
• ligandi bitopici
• ligandi bivalenti
• modulazione allosterica
• multi-target
• sistema endocannabinoide

Il sistema endocannabinoide (ECs) è un sistema di neuromodulazione lipidico i cui recettori, sia i più caratterizzati (CB1 e CB2), che quelli ancora in fase di studio (GPR55, GPR18 e altri), appartengono alla categoria dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR). Questa superfamiglia conta più di 800 recettori distribuiti in maniera ubiquitaria in tutto l’organismo e regola la maggior parte dei processi fisiologici. Per questo motivo tali recettori rappresentano il target di circa un terzo dei farmaci più venduti. Inoltre tutti i GPCR, nonostante le diverse classificazioni sulla base della posizione del sito di legame del ligando endogeno, o per grado di omologia nella sequenza amminoacidica, condividono la medesima struttura, che è caratterizzata da 7 domini trans-membranali (TM) collegati tra loro per mezzo di 3 anse extracellulari (ECL) e 3 intracellulari (ICL), una porzione amino-terminale sul versante extracellulare e una carbossi-terminale sul versante citoplasmatico.
Secondo la teoria classica, dualistica, la struttura di questi recettori esiste in equilibrio tra due sole conformazioni: una attiva e una inattiva; i vari ligandi, con le loro interazioni, possono stabilizzare la prima (agonisti) o la seconda (antagonisti). In completa contrapposizione, il modello attualmente riconosciuto prevede che, quando una molecola giunge in prossimità di un recettore, si vengano a definire delle interazioni specifiche atte a favorire la formazione di un complesso ligando-recettore stabile, che può non corrispondere a nessuna delle due forme citate (attiva e inattiva) riconosciute dalla teoria classica per il ligando. A seguito del legame con il ligando, si verificano cambiamenti conformazionali che si propagano anche al versante citoplasmatico della proteina, dove alcuni residui amminoacidici possono diventare accessibili ed interagire con le proteine poste alla base delle vie di propagazione del segnale (proteine G, Kinasi e β-arrestine).
La possibilità di generare diverse conformazioni stabili giustifica il fatto che agonisti per uno stesso recettore sono in grado di attivare vie di trasduzione del segnale diverse, dando origine al cosiddetto “Biased signaling” o “Functional selectivity”; mentre, il grado di stabilizzazione di una medesima conformazione può chiarire l’esistenza di agonisti e antagonisti parziali.
L'adattamento recettoriale è fortemente influenzato, oltre che dalle interazioni che il ligando è in grado di sviluppare, anche dalla posizione del sito di legame.
I siti ortosterici conservano circa il 44% della loro composizione amminoacidica e solitamente i ligandi ortosterici, in particolare quelli la cui struttura si ispira al ligando endogeno, tendono ad avere poca selettività per il sottotipo recettoriale, portando anche ad un’attivazione bilanciata di tutte le vie di segnalazione; ma è noto come invece strutture diverse, agendo ancora sul sito ortosterico, possono preferire alcune vie di segnale rispetto ad altre. Ciò può essere un vantaggio se consideriamo che alcune di queste vie sono in rapporto di antagonismo funzionale o che posso portare ad effetti collaterali.
Al fine di indurre una risposta “biased” anche per azione dei ligandi endogeni, è possibile sfruttare la modulazione allosterica. Molecole che legano il recettore su siti allosterici, quindi diversi da quello principale, producono un adattamento recettoriale che, sebbene spesso non in grado di dare avvio ad una risposta autonoma, può combinarsi con quello indotto da un ligando ortosterico e amplificare la risposta prodotta da un agonista verso un’unica via di trasduzione del segnale. Inoltre, sulla base di quanto la loro interazione riesca ad apportare beneficio alla stabilizzazione del complesso ligando endogeno- recettore- proteina effettrice, è possibile andare a modulare finemente l’attività del ligando endogeno. I PAMs (Positive Allosteric Modulators) possono migliorare l’affinità del complesso ligando recettore per le proteine effettrici, consentendo, a parità di dosaggio di ortosterico, di aumentare l’attività. Il loro opposto sono i NAMs, mentre i NALs (neutral allosteric ligands) non influenzano l’attività.
Oltre al vantaggio del “biased-signaling”, i ligandi allosterici rispondono ad altre prerogative, fra cui maggiore specificità per il sottotipo recettoriale, poiché i siti allosterici possiedono generalmente sequenze amminoacidiche meno conservate ed è dunque più probabile che un ligando allosterico riesca a legarsi efficacemente solo a un preciso sottotipo recettoriale, conferendo quindi selettività di azione e minori effetti collaterali. Quest’ultimi sono ridotti anche in virtù della saturabilità dell’effetto di cui godono i modulatori allosterici in quanto, essendo il loro effetto dipendente dal ligando ortosterico, una concentrazione crescente di ligando allosterico oltre la saturazione del sito di legame allosterico non aumenta l’entità dell’effetto dell’allosterico. Inoltre, ligandi allosterici, a differenza degli ortosterici, non sono in grado di attivare continuamente il recettore né le vie cellulari che portano a fenomeni di desensibilizzazione o down-regulation recettoriale.
Oltre alla modulazione allosterica, un altro espediente promettente per generare selettività funzionale consiste nello sviluppo di ligandi bitopici/dualsterici, ovvero composti ibridi che combinano due unità farmacoforiche, una del ligando ortosterico e l’altra di quello allosterico, collegate da un opportuno linker. Questi composti sono in grado di dare un legame simultaneo al sito ortosterico e allosterico dello stesso recettore, unendo le proprietà ortosteriche e allosteriche all'interno di un singolo composto. In effetti, questa strategia offre accesso a modulatori per i GPCRs con un notevole profilo di selettività funzionale, tissutale e recettoriale, in virtù del legame al sito allosterico, nonché una maggiore affinità dovuta al legame concomitante al sito ortosterico. I ligandi bitopici/dualsterici possono rivelarsi particolarmente utili in situazioni in cui il tono agonista endogeno viene progressivamente perso, come nei disturbi neurodegenerativi, grazie alla co-presenza del modulatore ortosterico e del modulatore allosterico. Inoltre, la somministrazione di un composto bitopico/dualsterico può avere alcuni effetti terapeutici additivi o sinergici, portando all'uso di una dose inferiore rispetto alla singola dose di ciascun composto “progenitore”. Infine, questo approccio innovativo può anche fornire nuovi ligandi “bias”, capaci di eludere i meccanismi di segnalazione alla base degli effetti collaterali che rappresentano il più grande ostacolo all'ingresso sul mercato dei composti attivi su CBR1 e CBR2. Date queste premesse, il mio lavoro di tesi si è concentrato nello sviluppo di nuovi potenziali ligandi bitopici/dualsterici selettivi per il recettore CBR2. I composti finali verranno testati mediante saggi di binding e funzionali.