• tumore del colon-retto
• colture cellulari
• citofluometria
• cellule dendritiche

Background. Tra le patologie tumorali, il carcinoma del colon-retto (CRC) è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni dopo resezione chirurgica è del 25-40%, nonostante i regimi di chemioterapia adiuvante.
Il sistema immunitario dei pazienti affetti da cancro è estremamente compromesso e incapace di esercitare una risposta anti-tumorale efficace. Alcuni meccanismi di tumor-escape coinvolgono le cellule dendritiche (DC), le più importanti cellule presentanti l’antigene, con un ruolo centrale nell’immunità sia innata che adattativa.
Le cellule dendritiche rappresentano solo lo 0.1-1% delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), e, nel loro stato immaturo, sono distribuite in maniera ubiquitaria in tutti i tessuti, dove svolgono la funzione di uptake e processazione di antigeni riconosciuti come non-self. Una volta catturato, le DC vanno incontro a maturazione, e migrano agli organi linfoidi secondari, dove presentano l’antigene ai linfociti T, generando una risposta immunitaria antigene-specifica.
In pazienti affetti da cancro alla prostata, alla mammella, e al fegato è stato osservato che diversi fattori prodotti dal tumore, quali VEGF, IL-6, IL-10, inducono difetti quantitativi e funzionali delle DC, che promuovono uno stato di tolerogenicità verso il tumore stesso.
Nei pazienti affetti da CRC sono stati eseguiti diversi studi circa il grado di infiltrazione intra-tumorale delle cellule del sistema immunitario, con risultati discordanti. Invece, studi concernenti lo status di queste cellule a livello sistemico sono ancora scarsi, nonostante la notevole importanza delle DC circolanti e di quelle derivate in vitro dai monociti (MoDC) al fine di ottenere una risposta anti-tumorale efficace, e di identificare nuovi approcci immunoterapici maggiormente efficienti e personalizzati per ogni singolo individuo.
Scopo dello studio. L’obiettivo di questo lavoro consiste nello studio dello status delle DC nei pazienti affetti da CRC al fine di contribuire a spiegare i meccanismi di tumor-escape e di identificare potenziali parametri immunologici utili per la stadiazione, la prognosi e la terapia. Inoltre la caratterizzazione delle DC in vitro potrebbe fornire utili criteri biologici per la valutazione delle DC come possibili candidati per l’approccio immunoterapico.
Metodi. 26 pazienti affetti da CRC sono stati inclusi nello studio, prima della resezione chirurgica, e caratterizzati per l’enumerazione ex vivo delle DC circolanti mieloidi (mDC) e plasmacitoidi (pDC), e per la valutazione in vitro della capacità dei monociti di differenziare in DC, confrontando i risultati con i controlli sani (HC). Inoltre le stesse analisi sono state eseguite a diversi time-point fino ad un massimo di 12 mesi dopo l’operazione chirurgica, al fine di definire lo status delle DC dopo trattamenti convenzionali, quali la chirurgia e/o la chemioterapia.
Le DC circolanti dei controlli e dei pazienti con CRC sono enumerate direttamente sul campione sangue periferico in toto raccolto in EDTA attraverso analisi citofluorimetrica multiparametrica. Le cellule dendritiche sono identificate come cellule CD14-CD16-CD85K+ e CD33+ o CD123+ per il subset mieloide e plasmacitoide, rispettivamente.
Per la generazione delle DC in vitro, le cellule mononucleate del sangue periferico sono isolate tramite gradiente di densità Ficoll-Hypaque da campioni dei controlli e dei pazienti raccolti in eparina. Le cellule CD14+ sono purificate dalle PBMCs tramite selezione immunomagnetica e coltivate alla concentrazione di 1x106 cell/ml in terreno RPMI 1640 completo supplementato con GM-CSF e IL-4 (both 50 ng/ml). Dopo 6 giorni di coltura, è aggiunto alla coltura LPS (100 ng/ml) per ulteriori 24 ore di incubazione, al fine di indurre la maturazione delle DC. Le analisi fenotipiche e funzionali sono eseguite tramite citofluorimetria sulle cellule coltivate non aderenti. Al giorno +6 la generazione delle MoDC è valutata tramite l’analisi dell’espressione della molecola CD14, e la funzionalità come capacità di fagocitare la sostanza FITC-destrano. Al giorno +7, la maturazione delle DC è determinata fenotipicamente tramite la valutazione dell’espressione delle molecole CD40, CD80, CD83 e HLA-DR, mentre a livello funzionale è valutata sia la capacità delle DC di indurre la proliferazione di linfociti T naïve, tramite il saggio di reazione linfocitaria mista (MLR), sia la secrezione di citochine in coltura da parte delle DC (IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α e TGF-β1) tramite analisi ELISA.
L’analisi statistica è effettuata utilizzando il software GraphPadPrism. I risultati sono espressi come valore medio ± errore standard della media (SEM). Differenze significative nel confronto tra i controlli sani e i pazienti sono determinate con il test di Student a due code o il test di Mann-Whitney, a seconda che i valori seguano una distribuzione normale o meno, rispettivamente. Valori di p<0.05 sono considerati statisticamente significativi.
Risultati. Al primo time-point, il numero assoluto di pDC nei pazienti è significativamente inferiore rispetto ai controlli, e ciò può essere principalmente attribuito ai pazienti in stadio III-IV. Il numero assoluto di mDC invece non mostra differenze rispetto ai controlli; il numero totale di DC circolanti nei pazienti in stadio III-IV è significativamente ridotto rispetto ai soggetti sani. Ai prelievi successivi, il numero di DC circolanti non mostra alcuna differenza rispetto ai controlli, suggerendo un recupero quantitativo dopo la rimozione del tumore.
Prima delle resezione chirurgica del tumore, i pazienti con CRC mostrano una compromessa capacità di generare DC in vitro, e di ottenere DC pienamente mature e funzionali, come mostrato dalla riduzione dell’espressione delle molecole co-stimolatorie e dell’antigene CD83. Inoltre, la secrezione di IL-10 da parte delle DC mature è significativamente superiore nei pazienti in stadio III-IV rispetto ai controlli e ai pazienti in stadio I, mentre la produzione di IL-12 e TNF-α è ridotta in maniera significativa nei pazienti in tutti gli stadi rispetto ai soggetti sani. Anche la capacità di stimolare la proliferazione di linfociti T allogenici appare significativamente inferiore nei pazienti di tutti gli stadi rispetto agli HC. Ai time-point successivi si osserva un recupero della capacità differenziativa, mentre quella maturativa permane significativamente compromessa, sia dopo resezione chirurgica, sia dopo trattamento chemioterapico, come mostrato dalle caratterizzazioni fenotipiche e funzionali. La compromissione delle DC sembra persistere fino a 12 mesi dopo l’operazione chirurgica, in particolare nei pazienti sottoposti a chemioterapia, anche se la coorte di pazienti deve essere incrementata per poter effettuare valutazioni statistiche.
Conclusioni. La compromissione del numero di DC circolanti e della capacità di generare in vitro DC pienamente mature e funzionali potrebbe rappresentare uno dei meccanismi di tumor-escape che si verifica nei pazienti con CRC. Queste alterazioni sono correlate alla progressione tumorale, dimostrando un peggioramento dello status del sistema immunitario non solo locale ma anche sistemico, con l’avanzamento del tumore. Inoltre, la capacità dei monociti di generare in vitro DC pienamente mature permane parzialmente compromessa anche dopo l’allontanamento del tumore e dopo trattamento chemioterapico, fino a 12 mesi dopo la resezione chirurgica. Questa osservazione richiede ulteriori investigazioni con una coorte di pazienti più numerosa e un follow-up più lungo, al fine di determinare il comportamento delle DC durante la malattia e la remissione. I nostri risultati inoltre orientano verso il non utilizzo di DC autologhe in pazienti affetti da cancro colon-rettale, in particolare di quelli in stadio avanzato di malattia, per approcci immunoterapici concernenti l’uso di vaccini basati sulle DC, in quanto esse risultano incapaci di indurre una efficiente proliferazione e attivazione dei linfociti T, e quindi una efficace risposta immunitaria anti-tumorale.
Considerando i numerosi tentativi di elaborare nuovi criteri di classificazione dei pazienti con cancro basati sul grado di reazione immunitaria a livello locale, che abbiano un valore prognostico superiore rispetto a quelli attuali, e quindi conseguenze importanti nella pratica clinica, si ritiene che lo studio delle proprietà fenotipiche e funzionali delle DC debba essere considerato come un argomento di estrema importanza.