• Craniofacial disorders
• Danio rerio
• Natural Killer Cell Triggering Receptor
• Neurodevelopmental disorder
• NKTR
• Orphan
• Zebrafish

Le malformazioni scheletriche facciali e i disturbi del neurosviluppo rappresentano un insieme di condizioni congenite spesso con una base genetica e molecolare ancora poco compresa.
Tra i geni implicati, NKTR (Natural Killer Cell Triggering Receptor) ha recentemente attirato l’attenzione per la sua potenziale responsabilità nella patogenesi di tali condizioni. NKTR è un gene situato sul cromosoma 3 del genoma umano (3p22.3) e codifica per una proteina di membrana espressa principalmente sulla superficie delle cellule Natural Killer (NK-cells), dove prende parte al riconoscimento e alla successiva attivazione della risposta citotossica contro le cellule bersaglio. Tuttavia, studi recenti hanno proposto che NKTR possa in realtà avere una funzione più ampia, in particolare durante lo sviluppo embrionale. La scoperta di varianti de novo di NKTR in pazienti affetti da una patologia genetica rara suggerisce che possa avere un ruolo nello sviluppo craniofacciale e cerebrale. I pazienti, portatori di una mutazione omozigote in NKTR, presentano un quadro clinico caratterizzato da disabilità intellettiva, condizioni neurodegenerative, malformazioni degli arti, difetti cardiaci congeniti e malformazioni craniofacciali.
L’obiettivo di questo studio è quello di indagare il ruolo di NKTR nello sviluppo scheletrico craniofacciale e del sistema nervoso centrale utilizzando Danio rerio (zebrafish) come modello animale.
Per identificare il pattern di espressione di nktr durante le fasi iniziali di sviluppo di zebrafish sono state condotte analisi di ibridazione in situ su embrioni wild-type fissati a diversi stadi (24, 48, 72 hpf e 5 dpf ). Successivamente, per indagare il coinvolgimento di nktr nella morfogenesi craniofacciale e cerebrale è stato generato un modello knockdown attraverso il sistema CRISPR-Cas13d. Il sistema, tramite la proteina Cas13, è in grado di riconoscere e degradare la sequenza di mRNA di nktr, riducendo l’espressione genica di nktr. Gli embrioni crispanti così ottenuti sono stati sottoposti a colorazioni con Alcian blue in modo da evidenziare l’eventuale presenza di alterazioni cartilaginee craniofacciali e, successivamente, a ibridazione in situ e immunofluorescenza whole-mount, al fine di osservare il pattern di markers specifici dello sviluppo craniofacciale.
Inoltre, sono state condotte analisi morfometriche sull’area cerebrale degli embrioni crispanti per valutare la presenza di alterazioni strutturali, compresa la microcefalia.
Da questi esperimenti è emerso che, a diversi stadi di sviluppo, nktr risulta espresso nelle strutture cartilaginee craniofacciali e nelle aree neuroproliferative dell’encefalo di zebrafish. Il knockdown di nktr indotto dal sistema CRISPR-Cas13d ha determinato negli embrioni crispanti alterazioni cartilaginee craniofacciali e cerebrali rispetto ai controlli, oltre che ad una deregolazione dell’espressione dei geni chiave della migrazione e differenziamento delle cellule della cresta neurale, come dlx2, suggerendo un potenziale coinvolgimento di nktr nella regolazione di questi processi biologici.
Infine, l’introduzione recente della linea mutante Sa37872 nel nostro stabulario offre
l'opportunità di validare i risultati finora ottenuti sui crispanti. La linea, attualmente in fase di caratterizzazione, presenta una mutazione puntiforme che provoca la formazione di un codone di stop prematuro, simile a quanto osservato nella variante umana.
I risultati ottenuti, seppur preliminari, forniscono informazioni utili ad accelerare l'identificazione di nuovi approcci terapeutici per disturbi del neurosviluppo associati a forme mutate di NKTR e pongono le basi per scoprire i meccanismi molecolari sottesi alla genesi di altre malattie genetiche rare.

Facial skeletal malformations and neurodevelopmental disorders represent a group of congenital conditions with a poorly understood genetic and molecular basis.
Among the implicated genes, NKTR (Natural Killer Cell Triggering Receptor) has recently attracted attention for its potential role in the pathogenesis of these conditions. NKTR is a gene located on chromosome 3 of the human genome (3p22.3) and encodes a membrane protein mainly expressed on the surface of Natural Killer cells (NK-cells), where it participates in the recognition and activation of the cytotoxic response against target cells. However, recent studies have proposed that NKTR may actually have a broader function, in particular during embryonic development. The discovery of de novo variants of NKTR in patients affected by a rare genetic disease suggests that it may play a role in craniofacial and brain development. Patients carrying a homozygous mutation in NKTR, show a clinical picture characterized by intellectual disability, neurodegenerative conditions, limb malformations, congenital heart defects and craniofacial malformations.
The aim of this study was to investigate the role of NKTR in craniofacial skeletal and central nervous system development using Danio rerio (zebrafish) as an animal model.
To identify the expression pattern of nktr during the early development stages of zebrafish, in situ hybridization analyses were performed on wild-type embryos fixed at different stages (24, 48, 72 hpf and 5 dpf). Subsequently, to investigate the involvement of nktr in craniofacial and brain morphogenesis, a knockdown model was generated using the CRISPR-Cas13d system. This system, through the Cas13 protein, is able to recognize and degrade the nktr mRNA sequence, reducing nktr gene expression. The resulting CRISPR-edited embryos were stained with Alcian blue in order to highlight potential craniofacial cartilage alterations and, later, whole-mount in situ hybridization and immunofluorescence were performed to observe the pattern of specific craniofacial development markers. Furthermore, morphometric analyses were conducted on the brain area of the crispant embryos to assess the presence of structural alterations, including microcephaly.
From these experiments it emerged that, at different developmental stages, nktr is expressed in the craniofacial cartilage structures and in the neuroproliferative areas of the zebrafish brain. Knockdown of nktr induced by the CRISPR-Cas13d system determined in crispant embryos craniofacial and cerebral cartilage alterations compared to controls, as well as a deregulation of the expression of key genes of migration and differentiation of neural crest cells, such as dlx2, suggesting a potential involvement of nktr in the regulation of these biological processes.
Finally, the introduction of the mutant line Sa37872 in our animal facility offers the opportunity to validate the results obtained on crispants embryos. The line, currently under characterization, carries a point mutation that causes the formation of a premature stop codon, similar to what is observed in the human variant.
The results obtained, even if preliminary, provide useful information to accelerate the identification of new therapeutic approaches for neurodevelopmental disorders associated with mutated forms of NKTR and lay the foundations for uncovering the molecular mechanisms underlying the genesis of other rare genetic diseases.