• chemioterapici
• colorectal cancer
• DSBs
• genotoxic stress
• HCT116
• ROS

Il cancro al colon-retto è una delle neoplasie maligne più comuni e diagnosticate in tutto il mondo; si stima che in Europa sia la seconda causa di morte negli uomini dopo il tumore ai polmoni, e la terza nelle donne, dopo il tumore al seno e ai polmoni.
Il trattamento chirurgico è la soluzione più efficace, soprattutto negli stadi iniziali del tumore, mentre la chemioterapia svolge un ruolo fondamentale di supporto sia al trattamento chirurgico sia negli stati più avanzati dove non è possibile intervenire diversamente. I farmaci chemioterapici più comunemente utilizzati (spesso in combinazione) sono l’oxaliplatino, l’irinotecan, il 5-fluorouracile e il paclitaxel. Ognuno di questi farmaci agisce attraverso un meccanismo che colpisce la proliferazione delle cellule tumorali, alterandone le fasi di sintesi, replicazione del DNA e segregazione dei cromosomi. Il ruolo genotossico di questi chemioterapici è stato affrontato in precedenti studi, e questo lavoro ha l’obiettivo di valutare se tale effetto si può manifestare attraverso l’induzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS).
I ROS sono di norma prodotti dall’organismo umano, e svolgono un importante ruolo sia a livello del sistema immunitario che nella comunicazione fra le cellule; di contro il nostro organismo ha sviluppato una serie di meccanismi per tenerne sotto controllo la concentrazione (processi “antiossidanti”). Tuttavia, nella condizione patologica in cui l’equilibrio tra processi ossidativi e antiossidanti sia alterata a favore dei primi (“stress ossidativo”), possono manifestarsi progressione di forme tumorali e danno cellulare.
Nell’ottica di verificare se l’impiego dei farmaci chemioterapici sopra citati comporti la formazione di ROS, sono stati effettuati trattamenti a dosi crescenti di oxaliplatino, irinotecan, 5-fluorouracile e paclitaxel su due linee cellulari di cancro colon rettale HCT116, una wild type per il gene codificante P53 (HCT116TP53+/+) e l’altra mutata per il gene codificante P53 (HCT116TP53-/-).
Lo scopo del lavoro è stato quindi verificare se i trattamenti coi chemioterapici , che determinano un effetto genotossico, inducono anche la formazione di ROS, e contestualmente comprendere se la presenza di P53 sia un fattore che influenza la sensibilità delle due linee cellulari a questi trattamenti.
L’evento di ossidazione è stato rilevato mediante l’utilizzo della sonda lipidica BODIPY581/591 C11, una sonda fluorescente sensibile alla perossidazione lipidica che si localizza nelle membrane delle cellule vive. La presenza dei ROS causa l’ossidazione di una porzione della membrana, determinando uno spostamento del picco di emissione di fluorescenza della sonda dal rosso (590nm) al verde (510nm). La localizzazione citoplasmatica della sonda ha consentito la visualizzazione delle cellule ossidate mediante microscopio a fluorescenza.
Per verificare l’efficacia della sonda BODIPY nel rilevare la formazione di ROS nelle due linee è stato utilizzato il perossido di idrogeno (H2O2), una molecola standard per l’induzione dei ROS. Tuttavia tale molecola presenta elevate instabilità e tossicità, ed è stato necessario applicare un tempo ridotto di trattamento (2h) per non incorrere in manifestazioni citotossiche. Poiché i chemioterapici impiegati prevedono trattamenti più lunghi (24h), si è ritenuto opportuno prevedere un controllo positivo che potesse agire nelle stesse condizioni di trattamento dei farmaci antitumorali. La scelta è ricaduta sul benzochinone, un composto organico intermedio cruciale nel metabolismo e nei processi ossido-riduttivi, e quindi sempre presente in caso di ossidazione da ROS.
I risultati ottenuti mostrano che tutti e quattro i chemioterapici inducono, in entrambe le linee cellulari, un aumento significativo dei livelli di specie reattive dell’ossigeno. Non sono state evidenziate inoltre differenze nella risposta d’induzione di ROS tra le due linee cellulari.
Colorectal cancer is one of the most common and diagnosed malignancies in the world; it is estimated that in Europe it is the second leading cause of death in men after lung cancer, and the third leading cause of death in women, after breast and lung cancer.
Surgical treatment is the most effective solution, especially in the early stages of the tumor, while chemotherapy plays a fundamental role in supporting both surgical treatment and in more advanced stages where no other intervention is possible. The most commonly used chemotherapy drugs (often in combination) are oxaliplatin, irinotecan, 5-fluorouracil and paclitaxel. Each of these drugs acts through a mechanism that affects the proliferation of tumor cells, altering the phases of DNA synthesis and replication and chromosome segregation. The genotoxic role of these chemotherapeutics has been addressed in previous studies, and this work aims to evaluate whether this effect can manifest itself through the induction of reactive oxygen species (ROS).
ROS are normally produced by the human body, and play an important role both in the immune system and in communication between cells; on the other hand, our body has developed a series of mechanisms to keep their concentration under control (antioxidant processes).
However, in the pathological condition in which the balance between oxidative and antioxidant processes is altered in favor of the former (“oxidative stress”), progression of tumor forms and cellular damage may occur.
In order to verify whether the use of the above-mentioned chemotherapeutic drugs leads to the formation of ROS, treatments with increasing doses of oxaliplatin, irinotecan, 5-fluorouracil and paclitaxel were carried out on two HCT116 colorectal cancer cell lines, one wild type for the gene encoding P53 (HCT116TP53+/+) and the other mutated for the gene encoding P53 (HCT116TP53-/-) Both cell lines are deficient in the mechanisms of “mismatch” repair (MMR) due to the bi-allelic homozygous mutation of the MLH1 gene, a key protein of the MMR system.
The aim of the work is therefore to verify whether treatments with chemotherapeutic drugs, which determine a genotoxic effect, also induce the formation of ROS, and at the same time to understand whether the presence of P53 is a factor that influences the sensitivity of the two cell lines to these treatments.
The oxidation event was detected using the lipid probe BODIPY581/591 C11, a fluorescent probe sensitive to lipid peroxidation that localizes in the membranes of living cells. The presence of ROS causes the oxidation of a portion of the membrane, determining a shift of the probe's fluorescence emission peak from red (590nm) to green (510nm). The cytoplasmic localization of the probe allowed the visualization of the oxidized cells by fluorescence microscopy.
To verify the effectiveness of the BODIPY probe in detecting the formation of ROS in the two lines, hydrogen peroxide (H2O2), a standard molecule for the induction of ROS, was used. However, this molecule presents high instability and toxicity, and it was necessary to apply a short treatment time (2h) to avoid incurring cytotoxic manifestations. Since the chemotherapeutic agents used require longer treatments (24h), it was considered appropriate to provide a positive control that could act in the same treatment conditions as the antitumor drugs. The choice fell on benzoquinone, an intermediate organic compound crucial in metabolism and oxidation-reduction processes, and therefore always present in case of oxidation by ROS.
The results obtained show that all four chemotherapeutic agents induce, in both cell lines, a significant increase in the levels of reactive oxygen species and that no differences in the induction response of these species were highlighted between the two cell lines.