• colorectal cancer
• DSB
• environmental mutagen
• genotoxic stress
• high mobility group
• high mobility group box 1
• HMGB1

Riassunto
High mobility group box 1 (HMGB1) è una proteina multifunzionale coinvolta in numerosi processi cellulari ed extracellulari. A livello del nucleo è principalmente implicata nel rimodellamento della cromatina e nel mantenimento della stabilità genomica. A livello citoplasmatico è coinvolta nell’induzione dell’autofagia e nell’inibizione dell’apoptosi. A livello extracellulare agisce come molecola di pattern molecolare associato a danno (damage-associated molecular pattern, DAMP) per mediare la risposta infiammatoria difensiva indotta da una condizione di stress cellulare. Proprio per le sue caratteristiche multifunzionali, HMGB1 sembra svolgere un ruolo controverso nello sviluppo e nella terapia del cancro. Localizzandosi nel nucleo, come proteina coinvolta nella riparazione del DNA, svolgerebbe un ruolo protettivo nei confronti della cancerogenesi, mentre, traslocando nell’ambiente extracellulare, promuovendo l’infiammazione può favorire la progressione tumorale. Dal momento che l’attività di HMGB1 è strettamente correlata alla sua localizzazione, per approfondire la conoscenza sul comportamento di suddetta proteina, in questo studio è stata esaminata la sua localizzazione in due linee cellulari di cancro colorettale umano: una linea proficiente di p53, HCT116TP53+/+; e una linea deficiente di p53, HCT116TP53-/-. Ciò è stato valutato sia in condizioni spontanee, sia in seguito a induzione di uno stress genotossico rappresentato dal trattamento in vitro con 1,4-benzochinone (BQ) e 1,2,3,4-diepossibutano (DEB). Come controllo positivo è stato utilizzato l’oxaliplatino, uno dei chemioterapici di elezione per il trattamento del cancro colorettale. Il composto causa danni al DNA legandosi covalentemente ad esso, inibendo la replicazione del DNA e inducendo il danno attraverso la formazione di addotti. Il BQ è il principale metabolita del benzene e la sua esposizione causa tumori ematopoietici come la sindrome mielodisplastica e la leucemia mieloide acuta. Il BQ induce rotture e riarrangiamenti cromosomici, stallo della forca replicativa e interferisce direttamente con l’attività della topoisomerasi di tipo I. Il DEB è il più potente metabolita attivo dell’1,3-butadiene, un inquinante atmosferico regolamentato in quanto mutagenico e cancerogeno, ed è noto per indurre formazione di legami crociati tra i filamenti di DNA.
Il danno genotossico è stato valutato con il saggio dei foci γ-H2AX, una metodica sperimentale basata sull’immunofluorescenza che sfrutta la capacità dell’isoforma istonica H2AX di essere rapidamente fosforilata sulla serina 139 in risposta a formazione di double strand break, creando foci visibili al microscopio. Il comportamento della proteina HMGB1 è stato caratterizzato tramite l’impiego di metodiche di immunofluorescenza al fine di determinarne la localizzazione cellulare. Con le modalità sopra descritte è stato possibile ottenere una visione dettagliata della risposta cellulare ai trattamenti, con un focus sulla capacità della proteina di rispondere al danno. I risultati ottenuti mostrano che, in un contesto di stress genotossico indotto da agenti chimici, la proteina HMGB1 trasloca dal citoplasma al nucleo, dimostrando di svolgere il suo ruolo di proteina associata alla cromatina e coinvolta nella riparazione.
Abstract
High mobility group box 1 (HMGB1) is a multifunctional protein involved in numerous cellular and extracellular processes. At nuclear level, it is mainly implicated in chromatin remodeling and maintenance of genomic stability. At cytoplasmic level, it is involved in the induction of autophagy and inhibition of apoptosis. At extracellular level, it acts as a damage-associated molecular pattern (DAMP) to mediate the defensive inflammatory response induced by a condition of cellular stress. Due to its multifunctional characteristics, HMGB1 seems to play a controversial role in the development and therapy of cancer. Localizing in the nucleus, as protein involved in DNA repair, HMGB1 plays a protective role against carcinogenesis, while translocating in the extracellular environment and promoting inflammation, it can enhance tumor progression. Since HMGB1 activity is closely related to its localization, to gain further insight into the behavior of this protein, in this study we examined its localization in two human colorectal cancer cell lines: a p53-proficient line, HCT116TP53+/+; and a p53-deficient line, HCT116TP53-/-. This was evaluated both under spontaneous conditions and after induction of genotoxic stress represented by in vitro treatment with 1,4-benzoquinone (BQ) and 1,2,3,4-diepoxybutane (DEB). Oxaliplatin, one of the chemotherapeutic agents of choice for the treatment of colorectal cancer, was used as a positive control. The compound causes DNA damage by covalently binding to it, inhibiting DNA replication and inducing damage through adduct formation. BQ is the main metabolite of benzene and its exposure causes hematopoietic cancers such as myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia. BQ induces chromosomal breaks and rearrangements, replication fork stalling, and directly interferes with type I topoisomerase activity. DEB is the most potent active metabolite of 1,3-butadiene, an air pollutant considered a human carcinogen, and is known to induce cross-linking between DNA strands.
Genotoxic damage was assessed with the γ-H2AX foci assay, an experimental method based on immunofluorescence that exploits the ability of the histone isoform H2AX to be rapidly phosphorylated on serine 139 in response to double strand break formation, creating foci visible under the microscope. The behavior of the HMGB1 protein was characterized by using immunofluorescence methods to determine its cellular localization. With the methods described above it was possible to obtain a detailed view of the cellular response to treatments, with a focus on the ability of the protein to respond to damage. The results obtained show that, in the context of genotoxic damage induced by chemical agents, HMGB1 translocates from the cytoplasm to the nucleus demonstrating a role as a chromatin-associated protein involved in DNA repair.