ETD

• intraneural injection
• minimally invasive
• pdms microparticles
• photothermal peripheral neuromodulation
• plasmonic gold nanoparticles
• two-photon polymerization

Peripheral nerve stimulation represents a compelling therapeutic strategy for a wide range of neurological and chronic pain disorders. Conventional approaches rely on implantable electrodes that, despite their clinical efficacy, are inherently invasive and frequently cause chronic tissue damage due to mechanical mismatch with soft neural tissue. Photothermal neuromodulation has emerged as a promising wireless and minimally invasive alternative, exploiting the ability of plasmonic gold nanoparticles (AuNPs) to transduce near-infrared (NIR) light into localised heat, thereby modulating the excitability of peripheral nerve fibres without direct electrical contact. However, the clinical translation of free AuNPs is hindered by critical issues including poor biocompatibility at high concentrations, uncontrollable biodistribution following injection, and rapid clearance from the target site by local macrophages. This thesis addresses these limitations by investigating the development of elastomeric microparticles as solid, biocompatible carriers for plasmonic nanoparticles, designed for minimally invasive intraneural injection and long-term retention within peripheral nerve tissue.

Preliminary Assessment: Hot Microemulsion

The project began with a systematic evaluation of a pre-existing fabrication protocol based on hot microemulsion of polydimethylsiloxane (PDMS). In this approach, a PDMS mixture doped with AuNPs — specifically gold nanorods (AuNRs) at concentrations up to 3.0 mM — is emulsified under mechanical agitation at elevated temperature, yielding spherical microbeads upon curing. Preliminary in vivo injections into peripheral nerve tissues confirmed the biological viability of the concept: the particles could be delivered intraneurally and were retained within the nerve fascicles, demonstrating the potential of the platform for photothermal neuromodulation.

However, a morphological characterisation revealed significant limitations inherent to the emulsion process. The resulting particle size distributions were broad, with diameters spanning from a few micrometres to over seventy micrometres. This lack of size control is particularly detrimental in an in vivo context, as smaller particles — below approximately 10 µm — can be rapidly cleared by local macrophages, compromising long-term retention. Furthermore, at the elevated AuNR concentrations required to maximise photothermal payload (~3.0 mM), the sulfur-containing stabilising coating of the nanoparticles severely poisoned the platinum-based catalyst responsible for PDMS crosslinking, leading to impractical curing times of up to five days, material loss, and dramatically reduced process yield that, given the nature of the fabrication strategy, is highly variable among batches.

Novel Fabrication Strategy: Two-Photon Polymerization

To overcome the morphological and chemical limitations of bulk emulsion, the core of this work focused on developing a fundamentally different fabrication approach based on Two-Photon Polymerization (2PP) direct laser writing, implemented on a Nanoscribe Photonic Professional GT2 system. 2PP exploits the nonlinear optical absorption of a photosensitive resin at the tight focus of a femtosecond laser to achieve three-dimensional polymerisation with sub-micrometre resolution, enabling the precise fabrication of microstructures with fully defined geometry and narrow size distribution.

The transition to 2PP required a change in base material: conventional PDMS, being a thermally cured elastomer, is inherently incompatible with photopolymerisation-based processes. IP-PDMS, a commercially available elastomeric photoresin developed by Nanoscribe and specifically formulated for 2PP processing, was therefore adopted as the matrix material. While this substitution allowed the platinum catalyst incompatibility of standard PDMS to be bypassed, it introduced new challenges. Plasmonic photoresins were prepared by doping IP-PDMS with two types of gold nanoparticles: AuNRs and gold bipyramids (AuBPs), both featuring a longitudinal localised surface plasmon resonance (LSPR) tuned to approximately 800–850 nm, well within the NIR biological transparency window targeted by the 780 nm laser source selected for photothermal activation. However, achieving colloidal stability of these nanoparticles within the photoresin matrix proved particularly difficult, as the resin's chemical environment promoted aggregation at higher loadings. Furthermore, the strong plasmonic absorption of the dopants at the 2PP writing wavelength (780 nm) partially overlapped with the photopolymerisation process, potentially interfering with the radical chain reactions responsible for resin curing. To address these issues, solvent evaporation protocols were developed and optimised to maximise AuNP loading while limiting aggregation, and printing parameter calibration was performed to compensate for the optical interference of the nanoparticles. UV-Vis spectroscopic characterisation of the doped resins confirmed the successful incorporation of both AuNR and AuBP at concentrations up to 0.8 mM, with the characteristic plasmonic signatures preserved, while aggregation observed at higher concentrations indicated the need for further optimisation of the resin–nanoparticle colloid.

Using the optimised doped resins, highly uniform spherical microparticles of 26 µm nominal diameter were successfully printed by 2PP. This target dimension was selected based on prior literature indicating that particles above ~10 µm effectively resist macrophage-mediated clearance while remaining compatible with intraneural injection. Morphological characterisation by scanning electron microscopy and optical microscopy confirmed the geometric fidelity and monodispersity of the printed structures, representing a substantial improvement over the emulsion-derived particles.

Comparative Evaluation and Conclusions

A direct comparative analysis of the two fabrication strategies highlights their complementary strengths and limitations. The hot microemulsion method retains potential for scalable bulk production, but is fundamentally unsuited for applications requiring precise size control, high AuNP loading, and batch-to-batch reproducibility. In contrast, 2PP direct laser writing delivers superior morphological precision, design flexibility, and compatibility with high-purity elastomeric resins, at the cost of currently limited nanoparticle loading concentrations — a limitation that can be addressed through optimisation of the nanoparticle surface functionalisation or the resin formulation, to improve colloidal stability at higher loadings.

This work establishes a methodological foundation for the rational engineering of injectable photothermal neural interfaces. The reproducibility and geometric control afforded by 2PP not only address the practical limitations of the emulsion approach, but also open a broader perspective: elastomeric microparticles with tuneable optical and mechanical properties represent a genuinely new class of hybrid microsystems, capable of interfacing with neural tissue in ways inaccessible to conventional bulk material approaches. Future work will focus on achieving colloidal stability at higher AuNP loadings through alternative surface functionalisations, scaling the 2PP fabrication throughput, and validating photothermal conversion efficiency of the printed particles using NIR laser illumination combined with infrared thermal imaging — ultimately paving the way towards a new generation of light-addressable, minimally invasive neural interfaces with direct translational relevance.

La stimolazione del sistema nervoso periferico rappresenta una strategia terapeutica promettente per un'ampia gamma di disturbi neurologici e del dolore cronico. Gli approcci convenzionali si basano su elettrodi impiantabili che, nonostante la loro efficacia clinica, sono intrinsecamente invasivi e causano frequentemente danni tissutali cronici a causa dell'incompatibilità meccanica con il tessuto neurale. La neuromodulazione fototermica è emersa come una valida alternativa wireless e minimamente invasiva, sfruttando la capacità delle nanoparticelle d'oro plasmoniche (AuNPs) di convertire la luce nel vicino infrarosso (NIR) in calore localizzato, modulando così l'eccitabilità delle fibre nervose periferiche senza contatto elettrico diretto. Tuttavia, la traduzione clinica delle AuNPs libere è ostacolata da problemi critici tra cui la scarsa biocompatibilità ad alte concentrazioni, la biodistribuzione incontrollabile dopo l'iniezione e la rapida eliminazione dal sito bersaglio da parte dei macrofagi locali. Questa tesi affronta tali limitazioni investigando lo sviluppo di microparticelle elastomeriche come carrier solidi e biocompatibili per nanoparticelle plasmoniche, progettate per l'iniezione intraneurale minimamente invasiva e la ritenzione a lungo termine nel tessuto nervoso periferico.

Valutazione Preliminare: Microemulsione a Caldo

Il progetto è iniziato con una valutazione sistematica di un protocollo di fabbricazione preesistente basato sulla microemulsione a caldo di polidimetilsilossano (PDMS). In questo approccio, una miscela di PDMS drogata con AuNPs — specificamente nanorods d'oro (AuNRs) a concentrazioni fino a 3,0 mM — viene emulsionata sotto agitazione meccanica ad alta temperatura, producendo microparticelle sferiche dopo la reticolazione. Le iniezioni preliminari in vivo nel tessuto nervoso periferico hanno confermato la validità biologica del concetto: le particelle potevano essere somministrate per via intraneurale e ritenute all'interno dei fasci nervosi, dimostrando il potenziale della piattaforma per la neuromodulazione fototermica.

Tuttavia, la caratterizzazione morfologica ha rivelato limitazioni significative intrinseche al processo di emulsione. Le distribuzioni dimensionali delle particelle risultanti erano ampie, con diametri compresi tra pochi micrometri e oltre settanta micrometri. Questa mancanza di controllo dimensionale è particolarmente svantaggiosa in un contesto in vivo, poiché le particelle più piccole — al di sotto di circa 10 µm — possono essere rapidamente eliminate dai macrofagi locali, compromettendo la ritenzione a lungo termine. Inoltre, alle elevate concentrazioni di AuNR necessarie per massimizzare il carico fototermico (~3,0 mM), il rivestimento stabilizzante contenente zolfo delle nanoparticelle ha causato il grave avvelenamento del catalizzatore a base di platino responsabile della reticolazione del PDMS, portando a tempi di cura impraticabili fino a cinque giorni, perdita di materiale e resa del processo drammaticamente ridotta e altamente variabile tra i lotti.

Nuova Strategia di Fabbricazione: Polimerizzazione a Due Fotoni

Per superare le limitazioni morfologiche e chimiche dell'emulsione bulk, il cuore di questo lavoro si è concentrato sullo sviluppo di un approccio di fabbricazione fondamentalmente diverso basato sulla scrittura laser diretta per Polimerizzazione a Due Fotoni (2PP), implementata su un sistema Nanoscribe Photonic Professional GT2. La 2PP sfrutta l'assorbimento ottico non lineare di una resina fotosensibile nel fuoco ristretto di un laser a femtosecondi per ottenere una polimerizzazione tridimensionale con risoluzione sub-micrometrica, consentendo la fabbricazione precisa di microstrutture con geometria completamente definita e distribuzione dimensionale ristretta.

Il passaggio alla 2PP ha reso necessaria una sostituzione del materiale di base: il PDMS convenzionale, essendo un elastomero a reticolazione termica, è intrinsecamente incompatibile con i processi basati sulla fotopolimerizzazione. È stata pertanto adottata come materiale matrice l'IP-PDMS, una fotoresina elastomerica commercialmente disponibile sviluppata da Nanoscribe e specificamente formulata per la lavorazione 2PP. Sebbene questa sostituzione abbia permesso di aggirare l'incompatibilità con il catalizzatore al platino del PDMS standard, ha introdotto nuove criticità. Le fotoresine plasmoniche sono state preparate drogando IP-PDMS con due tipi di nanoparticelle d'oro: AuNRs e bipiramidi d'oro (AuBPs), entrambe con risonanza plasmonica di superficie localizzata (LSPR) longitudinale sintonizzata a circa 800–850 nm, ben all'interno della finestra di trasparenza biologica NIR presa di mira dalla sorgente laser a 780 nm selezionata per l'attivazione fototermica. Tuttavia, raggiungere la stabilità colloidale di queste nanoparticelle all'interno della matrice della fotoresina si è rivelato particolarmente difficile, poiché l'ambiente chimico della resina favorisce l'aggregazione a carichi più elevati. Inoltre, il forte assorbimento plasmonico dei droganti alla lunghezza d'onda di scrittura 2PP (780 nm) si sovrapponeva parzialmente al processo di fotopolimerizzazione, interferendo potenzialmente con le reazioni a catena radicalica responsabili della reticolazione della resina. Per affrontare questi problemi, sono stati sviluppati e ottimizzati protocolli di evaporazione del solvente per massimizzare il carico di AuNP limitando l'aggregazione, ed è stata eseguita una calibrazione dei parametri di stampa per compensare l'interferenza ottica delle nanoparticelle. La caratterizzazione spettroscopica UV-Vis delle resine drogate ha confermato la riuscita incorporazione di AuNR e AuBP a concentrazioni fino a 0,8 mM, con le principali caratteristiche plasmoniche preservate, mentre l'aggregazione osservata a concentrazioni più elevate ha indicato la necessità di un'ulteriore ottimizzazione del colloide resina–nanoparticelle.

Utilizzando le resine drogate ottimizzate, microparticelle sferiche altamente uniformi di diametro nominale di 30 µm sono state stampate con successo tramite 2PP. Questa dimensione target è stata selezionata sulla base della letteratura preesistente che indica che le particelle superiori a ~10 µm resistono efficacemente alla clearance mediata dai macrofagi, rimanendo compatibili con l'iniezione intraneurale. La caratterizzazione morfologica tramite microscopia elettronica a scansione e microscopia ottica ha confermato la fedeltà geometrica e la monodispersità delle strutture stampate, rappresentando un miglioramento sostanziale rispetto alle particelle derivate dall'emulsione.

Valutazione Comparativa e Conclusioni

Un'analisi comparativa diretta delle due strategie di fabbricazione evidenzia i loro punti di forza e limitazioni complementari. Il metodo della microemulsione a caldo mantiene un potenziale per la produzione bulk scalabile, ma è fondamentalmente inadatto per applicazioni che richiedono controllo dimensionale preciso, alto carico di AuNP e riproducibilità tra lotti. Al contrario, la scrittura laser diretta 2PP offre una precisione morfologica superiore, flessibilità di progettazione e compatibilità con resine elastomeriche ad alta purezza, al costo di concentrazioni di carico di nanoparticelle attualmente limitate — una limitazione che può essere affrontata attraverso l'ottimizzazione della funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle o della formulazione della resina, per migliorare la stabilità colloidale a carichi più elevati.

Questo lavoro stabilisce una base metodologica per l'ingegnerizzazione razionale di interfacce neurali fototermiche iniettabili. La riproducibilità e il controllo geometrico offerti dalla 2PP non solo affrontano le limitazioni pratiche dell'approccio a emulsione, ma aprono anche una prospettiva più ampia: le microparticelle elastomeriche con proprietà ottiche e meccaniche sintonizzabili rappresentano una genuinamente nuova classe di microsistemi ibridi, capaci di interfacciarsi con il tessuto neurale in modi inaccessibili agli approcci convenzionali basati su materiali bulk. Il lavoro futuro si concentrerà sul raggiungimento della stabilità colloidale a carichi di AuNP più elevati attraverso funzionalizzazioni superficiali alternative, sull'aumento della produttività della fabbricazione 2PP e sulla validazione dell'efficienza di conversione fototermica delle particelle stampate tramite illuminazione laser NIR combinata con imaging termico a infrarossi — aprendo in ultima analisi la strada verso una nuova generazione di interfacce neurali minimamente invasive indirizzabili con la luce, con diretta rilevanza traslazionale.