• biofilm
• cystic fibrosis
• immunomodulation
• Lacticaseibacillus rhamnosus
• PBMC
• postbiotics
• Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa rappresenta un importante patogeno umano, responsabile di gravi infezioni in individui immunocompromessi, pazienti ospedalizzati o con patologie in atto. Il patogeno è particolarmente rilevante in pazienti con fibrosi cistica nei quali causa gravi infezioni polmonari che tendono a cronicizzare ed a portare ad una progressiva perdita della funzione polmonare, spesso causa della morte di questi pazienti. La terapia delle infezioni da P. aeruginosa è particolarmente complicata dalla resistenza intrinseca e acquisita del batterio a molti antibiotici convenzionali e dalla sua capacità di produrre numerosi fattori di virulenza e di formare biofilm. Quest’ultimo è una forma di vita notoriamente resistente non solo al trattamento antibiotico, ma anche alla eradicazione da parte del sistema immunitario dell’ospite. La circolazione di ceppi di P. aeruginosa multi-resistenti o addirittura pan-resistenti agli antibiotici ha stimolato l’identificazione di approcci terapeutici innovativi per contrastare le infezioni causate da questo batterio. Inoltre, l’intensa risposta pro-infiammatoria che spesso si associa alle infezioni da P. aeruginosa richiede strategie che combinino l'azione antibatterica con un effetto immunomodulante.
Un promettente approccio emergente, in questo contesto, è l'uso di probiotici o dei loro prodotti bioattivi. Studi recenti in modelli animali ed in vitro hanno infatti dimostrato che probiotici, appartenenti ai batteri lattici, possono con vari meccanismi ridurre la carica batterica ed inibire l'adesione di P. aeruginosa a cellule epiteliali polmonari, modulando al contempo la risposta infiammatoria dell’ospite. Tali ricerche hanno anche dimostrato che gli effetti benefici dei probiotici sono solo parzialmente attribuibili alla loro vitalità, poiché anche preparazioni inanimate derivate dai probiotici, i così detti postbiotici (ad esempio microbi non vitali, i loro componenti cellulari o i loro metaboliti) possono esercitare attività biologiche con potenziale terapeutico. I postbiotici possono superare alcuni dei problemi di sicurezza correlati all'uso di probiotici vivi come la trasmissione della resistenza agli antibiotici, la possibilità di infezioni sistemiche in individui vulnerabili, la perdita di vitalità durante la preparazione e la conservazione e, per tale motivo, essi sono al momento oggetto di intensi studi per valutare il loro possibile impiego come agenti-antinfettivi.
Studi precedenti del laboratorio dove è stata condotta la tesi hanno dimostrato che postbiotici di Lacticaseibacillus rhamnosus, nella forma di supernatanti acellulari di coltura (cell free supernatants, CFS) esercitano marcate proprietà antibatteriche, antibiofilm e antivirulenza contro ceppi clinici di P. aeruginosa isolati dall’espettorato di pazienti con fibrosi cistica.
Scopo del presente lavoro di tesi è stato inizialmente quello di valutare l’efficacia antibatterica dei CFS in un modello in vitro di infezione polmonare all’interfaccia aria acqua (air liquid interface- ALI- lung infection model) per mimare il più possibile le condizioni locali delle vie respiratorie infette. Successivamente i postibiotici sono stati suddivisi in due frazioni, a basso e ad alto peso molecolare (≤ 3 kDa e > 3 kDa, rispettivamente) per valutare quale di esse fosse la frazione responsabile dell’attività antibatterica ed antibiofilm. Infine i CFS non frazionati, e le loro
frazioni ad alto e basso peso molecolare sono stati utilizzati in saggi di stimolazione in vitro di cellule mononucleate di sangue periferico umano (PBMC) per valutare anche la loro eventuale azione immunomodulante.
I risultati ottenuti hanno dimostrato che quando testati nel modello ALI, i CFS non frazionati hanno mostrato un marcato effetto antibatterico a concentrazioni non tossiche, riducendo la conta delle colony forming units (CFU) di P. aeruginosa fino a 3 Log dopo 7 ore di incubazione. Questi risultati sono stati confermati dall'imaging con microscopia elettronica a scansione.
Sia l’attività antibatterica che quella antibiofilm sono state principalmente, ma non esclusivamente, attribuite alla frazione a basso peso molecolare (CFS ≤ 3 kDa) che ha anche trattenuto la maggior parte del contenuto di acido lattico dei sopranatanti. La frazione CFS > 3 kDa è risultata inattiva, ma ha mostrato un effetto antibatterico sinergico quando ricostituita con la frazione CFS ≤ 3 kDa.
Dopo 24 ore di stimolazione dei PBMC con lipopolisaccaride (LPS) o con P. aeruginosa intatto, ucciso ai raggi ultravioletti, è stato dimostrato un marcato effetto antinfiammatorio dei CFS non frazionati così come della frazione ≤ 3kDa a concentrazioni non tossiche, mentre la frazione > 3kDa induceva la produzione di IL-6, TNF-α e, in misura minore, di IL-10, suggerendo la presenza in questa frazione di componenti parietali di L. rhamnosus ad attività pro-infiammatoria.
Nel complesso, questi risultati supportano l’attuale ipotesi che i postbiotici possano rappresentare opzioni terapeutiche innovative per trattare infezioni croniche che comportano anche una forte risposta infiammatoria, come quelle causate da P. aeruginosa.