• A549
• cN-II
• silenziamento

La 5’-nucleotidasi citosolica di tipo II (cN-II) è un enzima del catabolismo purinico appartenente ad una famiglia di fosfoesterasi con differente localizzazione, specificità di substrato e regolazione. L’enzima è stato purificato da diverse fonti e presenta una distribuzione ubiquitaria; se ne conoscono attivatori, inibitori, costanti cinetiche, struttura e meccanismo di azione. La cN-II può essere considerata un enzima bifunzionale, in quanto catalizza il trasferimento di un gruppo fosfato da un nucleotide donatore ad un nucleoside accettore, passando attraverso la formazione di un intermedio covalente enzima-fosfato. Il gruppo fosfato legato al sito attivo dell’enzima può essere idrolizzato da una molecola d’acqua oppure essere ceduto ad un nucleoside accettore (Pesi, et al., 1994).
La cN-II citosolica è attiva nei confronti dei nucleosidi 6-idrossipurinici 5’-monofosfato (IMP, dIMP, GMP, dGMP, XMP) e può trasferire il gruppo fosfato ad un ristretto numero di nucleosidi come inosina, deossiinosina ed alcuni analoghi utilizzati in terapie antivirali e antitumorali. Il ruolo fisiologico dell’enzima è quello di contribuire all’omeostasi della concentrazione di IMP e di tutti i composti purinici da esso derivanti.
Il meccanismo catalitico e la struttura dell’enzima, sono caratteristici della superfamiglia delle aloacido dealogenasi a cui l’enzima appartiene.
La regolazione enzimatica è complessa e dipende dalla carica energetica della cellula. ATP, ADP, (2,3 bifosfoglicerato), Ap4A (diadenosinatetrafosfato), polifosfati e alte concentrazioni di KCl attivano l’enzima, mentre il fosfato è l’unico inibitore noto; l’enzima necessita, inoltre, come cofattore Mg2+ ed ha la massima attività in ambiente riducente.
Alterazioni dell’attività della cN-II sono state evidenziate in pazienti affetti dalla sindrome di Lesch-Nyan (Pesi, et al., 2000) grave disturbo neurologico e comportamentale, mentre è controverso il ruolo dell’enzima nelle neoplasie ematologiche: diversi autori mostrano come elevati livelli di mRNA della cN-II in pazienti adulti affetti da leucemia mieloide acuta e trattati con citarabina, siano un marker statisticamente significativo di un peggior successo terapeutico. Considerando che la citarabina monofosfato non è substrato dell’enzima, è stato ipotizzato che il livello del mRNA della cN-II rifletta lo stato proliferativo delle cellule e sia quindi un marker di una forma più severa della patologia (Galmarini, et al., 2003).
In base alle caratteristiche cinetiche dell’enzima si ritiene che il ruolo della cN-II sia l’idrolisi dell’eccesso di IMP in condizioni di elevata carica energetica cellulare. In condizioni ischemiche l’attività dell’enzima decresce, prevenendo la perdita dei nucleotidi purinici.
Nonostante la cN-II sia deputata al catabolismo purinico, è risultata presente ad alti livelli in tutte le cellule che proliferano velocemente, come per esempio nella mucosa intestinale, nei tessuti ghiandolari ed in molte cellule tumorali. Queste osservazioni hanno spinto numerosi ricercatori ad approfondire le conoscenze sul ruolo dell’enzima.
A questo scopo sono stati preparati diversi modelli cellulari silenziati per cN-II. È noto da precedenti esperimenti che un silenziamento parziale dell’enzima in cellule di astrocitoma induca apoptosi (Resta, 1993; Careddu, et al., 2008).
Durante il mio studio ho utilizzato cellule di carcinoma polmonare (A549) silenziate per cN-II.
Lo studio è focalizzato sulla valutazione di eventuali differenze metaboliche e fenotipiche tra cellule controllo ingegnerizzate con un plasmide che codifica per una sequenza priva di target intracellulare (pScont) e cellule ingegnerizzate con un plasmide, in cui è inserito uno short-hairpin, per silenziare il gene che codifica per la cN-II (pScN-II). Il silenziamento del 60% è stato valutato con il metodo radio-enzimatico. I due tipi cellulari sono stati coltivati sia in assenza che in presenza di 2-deossiglucosio (20 mM), inibitore della glicolisi, al fine di valutare la capacità proliferativa delle cellule e le eventuali alterazioni metaboliche e funzionali legate alla diversa espressione della proteina. Sono stati analizzati specifici marker proteici quali: mTOR totale e fosforilata, PGC1-alpha, ERK totale e fosforilata, p70S6K totale e fosforilata, p53 totale e fosforilata ed LC3-II.
I risultati preliminari indicano che l’elevata espressione di cN-II, quale si trova nei tumori molto aggressivi, è legata ad un fenotipo glicolitico con alta velocità di sintesi proteica; il silenziamento di cN-II determina un fenotipo più ossidativo con aumento della massa e della funzionalità mitocondriale, una diminuzione della sintesi proteica e della motilità osservata mediante saggi di motilità, un’aumentata fosforilazione di p53 ed un incremento dell’autofagia.