• oxidative stress
• stress ossidativo. Extracellular vesicles
• Vescicole extracellulari

RIASSUNTO
Contesto: La malattia mixomatosa della valvola mitralica (MMVD) è la patologia acquisita più comune nei cani. Durante la progressione della MMVD, lo stress ossidativo aumenta, portando ad un accumulo di lipofuscina nel miocardio. In medicina umana, le vescicole extracellulari (EVs) sono state identificate come un potenziale biomarcatore di patologie cardiovascolari grazie alla loro correlazione con la gravità della malattia e i cambiamenti strutturali del cuore. Tuttavia, il loro ruolo nella MMVD canina rimane inesplorato. Questo studio ha l’obbiettivo di valutare le variazioni del numero di EVs e del loro contenuto di lipofuscina in cani con differenti stadi di gravità della MMVD. Si ipotizza che le EVs possano avere il ruolo di biomarcatore di stress ossidativo nella MMVD nei cani.
Metodi: Il presente studio prospettico ha coinvolto cani di proprietà sani e affetti da MMVD. Le vescicole extracellulari (EVs) plasmatiche sono state isolate attraverso centrifugazione seriale e analizzate con citometria a flusso per valutare la loro concentrazione e l'auto-fluorescenza rossa (PC5.5), la quale è indicativa della presenza di lipofuscina. Le analisi statistiche hanno incluso il test di confronto multiplo di Kruskal-Wallis Dunn e la correlazione di Spearman per valutare le associazioni tra i parametri delle EV, la gravità della MMVD e i parametri clinici ed ecocardiografici (età, peso corporeo, velocità dell'onda E, rapporto E/A e MINE score).
Risultati: Lo studio ha incluso 53 cani, di cui 11 cani sani (controllo) e i restanti cani affetti da malattia MMVD classificati secondo le linee guida ACVIM nei gruppi B1 (n=10), B2 (n=7) e C (n=25). Il peso mediano era significativamente diverso tra i gruppi (p<0,0001). L'analisi della citometria a flusso ha rivelato una concentrazione di EV significativamente più bassa nel gruppo B1 rispetto al gruppo di controllo (p=0,017), mentre PC5.5 era significativamente più alta nello stadio C rispetto a B1 e B2 (p=0,001; p=0,003). Dopo la normalizzazione del peso, le EV/Kg sono aumentate significativamente nello stadio C rispetto allo stadio B1 (p=0,0003) e PC5.5/Kg è aumentato significativamente nello stadio C rispetto agli altri gruppi (p<0,0001). Le analisi di correlazione hanno mostrato che PC5.5/Kg era associato a marcatori di gravità della malattia quali: MINE score (r=0,5, p=0,0003) e rapporto E/A (r=0,6, p<0,0001).
Conclusioni: I nostri risultati indicano che i cani con MMVD avanzata (stadio C) mostrano livelli più alti di stress ossidativo, riflesso nell’aumento della lipofuscina associata alle EV. Questi risultati suggeriscono che il contenuto di lipofuscina delle EV potrebbe rappresentare un nuovo biomarcatore di severità della MMVD, offrendo potenziali applicazioni cliniche nel monitoraggio e nella gestione della malattia.


ABSTRACT
Background: Myxomatous mitral valve disease (MMVD) is the most common acquired heart disease in dogs. As MMVD progresses, oxidative stress increases, leading to the accumulation of lipofuscin in the myocardium. In human medicine, extracellular vesicles (EVs) have been identified as potential biomarkers of cardiovascular diseases due to their association with disease severity and structural heart changes. However, their role in canine MMVD remains unexplored. This study aimed to evaluate changes in the number and lipofuscin content of EVs among dogs with different MMVD severities. We hypothese that EVs may serve as biomarkers of oxidative stress in MMVD dogs.
Methods: This was an observational and prospective study including healthy and MMVD dogs. Plasma EVs were isolated via serial centrifugation and analyzed using flow cytometry to assess the concentration and red autofluorescence (PC5.5) indicative of lipofuscin presence. Statistical analyses included the Kruskal-Wallis Dunn’s multiple comparison test and the Spearman correlation to evaluate associations between EVs concentration and autofluorescence with MMVD severity (E/A ratio and MINE score).
Results: The study included 53 dogs, 11 healthy-control dogs and dogs classified according to ACVIM guidelines into B1 (n=10), B2 (n=7), and C (n=25) groups. The median weight was significant different between groups (p<0.0001). Flow cytometry analysis revealed a significantly lower concentration EVs in the B1 group compared to controls (p=0.017), while PC5.5 was significantly higher in stage C compared to B1 and B2 (p=0.001; p=0.003). After weight normalization, EVs/Kg was significantly increased in stage C vs stage B1 (p=0.0003) and PC5.5/Kg was significantly increased in stage C compared to other groups (p<0.0001). Correlation analysis showed that PC5.5/Kg was associated with disease severity markers: MINE score (r=0.5, p=0.0003) and E/A ratio (r=0.6, p<0.0001).
Conclusion: Our findings indicate that dogs with advanced MMVD (stage C) exhibit higher oxidative stress levels, reflected in increased EV-associated lipofuscin. These results suggest that lipofuscin content in EVs could be a novel biomarker for MMVD severity, offering potential clinical applications in disease monitoring and management.