• NIRS
• oxygen saturation
• thenar eminence

La spettroscopia NIR è una tecnica diagnostica in grado di misurare l’ossigenazione tissutale in modo non invasivo utilizzando un mezzo innocuo per i tessuti biologici: la radiazione ottica nella banda spettrale nel vicino infrarosso (700÷2000 nm). Nella configurazione di misura più semplice, la spettroscopia NIR consiste nell’investire un tessuto biologico con un segnale luminoso a bassa potenza (pochi mW) e nel monitorare il segnale riemesso dal tessuto stesso a seguito dei fenomeni di diffusione e assorbimento che avvengono internamente. La diffusione è il processo predominante nella banda spettrale NIR utilizzata in spettroscopia (650÷950 nm); si parla di fotoni trasmessi o riflessi a seconda della direzione di uscita rispetto a quella di ingresso e tale fenomeno è alla base del tipico percorso a zig-zag del fotone, una traiettoria semiellissoidale (denominata “banana shape”) all’interno del bersaglio. L’assorbimento da parte del tessuto biologico invece è piuttosto basso e principalmente dovuto all’emoglobina e all’acqua (picco a 970 nm), in percentuali diverse a seconda della lunghezza d’onda, e in parte minore alla citocromo ossidasi (CtOx , picco a 830 nm) e ad altri cromofori. L’emoglobina ossigenata (HbO2 , picco a 920 nm) e deossigenata (dHb, picco a 760 nm) hanno spettri di assorbimento diversi nella regione NIR: questa proprietà permette di ricavare separatamente le concentrazioni delle due specie di emoglobina e quindi il livello di saturazione dell’ossigeno nel sangue (StO2) come rapporto tra la forma ossigenata e la somma di ossigenata e deossigenata.
Le tecnologie commerciali in campo biologico convergono in due aree: l’ossimetria dei tessuti, che fornisce una misura percentuale assoluta singola di ossigenazione tissutale, e la tomografia ottica, che permette di ricavare mappe dell’ossigenazione del sangue di un tessuto biologico.
L’obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare un nuovo dispositivo di imaging di spettroscopia NIR, il KC103 - “Kent Camera Multispectral Imaging Device” della Kent Imaging Inc presente all’Istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa per fini di ricerca. In particolare è stata valutata la possibilità di utilizzare il dispositivo per studi sul micro- e macro- circolo e per applicazioni sperimentali quali lo studio dell'evoluzione temporale delle lesioni cutanee e lo studio della variazione dell'ossigenazione superficiale al variare del protocollo di anestesia.
Il KC103 è uno strumento portatile costituito da una struttura carrellata con un monitor touchscreen orientabile cui è collegato un braccio snodabile che termina con la testa del dispositivo. Il monitor contiene al suo interno l’hardware e il software di elaborazione. La testa è orientabile e ruotabile in tutte le direzioni e contiene al suo interno l’hardware di acquisizione (una camera CCD), una matrice di LED come sorgente luminosa NIR e sei diodi puntatori laser per aiutare nella ricerca della messa a fuoco e nel posizionamento. Il dispositivo acquisisce immagini a quattro lunghezze d’onda (670 nm, 735 nm, 890 nm e 940 nm) tali da escludere i picchi di assorbimento di CtOx e acqua ed eccitare selettivamente ossi- e deossi- emoglobina e restituisce in uscita due file DICOM, uno contenente le quattro immagini alle quattro lunghezze d’onda e uno contenente la mappa di ossigenazione da esse ricavata. La disponibilità delle immagini alle quattro lunghezze d’onda, ha permesso di derivare, a partire dalla legge di Lambert-Beer modificata per mezzi complessi, le mappe di concentrazione di ossi e deossi emoglobina.
Come emerso di recente in letteratura, studi sulla circolazione vengono effettuati con successo con la spettroscopia NIR utilizzando sensori puntuali posizionati sull’eminenza tenare e compiendo un monitoraggio continuo di StO2 durante un VOT (vascular occlusion test). Tale test prevede di posizionare il bracciale di uno sfigmomanometro sull’avambraccio, gonfiarlo a una pressione superiore alla pressione arteriosa del soggetto e rilasciarla dopo un certo intervallo di tempo, monitorando StO2 per tutto il tempo. Non esiste tuttavia un modo standard per condurre il test, non essendoci concordanza sul valore di pressione a cui gonfiare il bracciale e sulla durata dell’ischemia e del tempo di recupero post-ischemia. Tali tipi di studi, inoltre, non sono mai stati condotti utilizzando dispositivi di imaging.
L’obiettivo iniziale del presente lavoro di tesi è stato quindi quello di definire un opportuno protocollo di acquisizione per il VOT: 1) acclimatamento del soggetto alla temperatura ambiente per 5 minuti circa, misura della pressione arteriosa e acquisizione immagini basali; 2) induzione di un’ischemia temporanea (5 minuti) gonfiando il bracciale della pressione a 50 mmHg sopra il valore misurato a riposo e acquisizione immagini ogni 10 secondi per il primo minuto e poi ogni 30 secondi per i restanti 4 minuti; 3) rilascio rapido della pressione del bracciale e acquisizione immagini per 7 minuti, a raffica ogni 7-10 secondi per il primo minuto e poi ogni 30 secondi per i rimanenti 6 minuti.
Lo studio effettuato nella presente tesi è stato condotto su 15 soggetti ambosessi e in condizioni di buona salute. Tre soggetti sono stati scartati poiché si erano mossi durante il test, un altro poiché mostrava valori di ossigenazione basale significativamente inferiori alla media degli altri soggetti. Le curve di StO2 che si ottengono in risposta al VOT sono state ricavate andando a graficare nel tempo il valore di saturazione medio calcolato, per ciascuna immagine acquisita, all’interno di una ROI posizionata sull’eminenza tenare. Sono state utilizzate ROI circolari, ellissoidali o libere disegnate dall'utente per ricavare gli andamenti complessivi ed escludere i soggetti che si erano mossi ed eventuali outlier singoli di ciascun soggetto. Il valore utilizzato per l’analisi statistica è stato ricavato come media tra i valori medi ottenuti utilizzando otto ROI ellissoidali con asse maggiore compreso tra 15 e 25 mm per emulare la zona investigata dai sensori puntuali. Le stesse ROI sono state utilizzate sulle mappe di concentrazione di ossi- e deossi- emoglobina calcolate in precedenza per graficarne i relativi andamenti qualitativi nel tempo.
Nelle curve di saturazione ottenute i parametri presi in considerazione sono stati il rate di decrescita di StO2 a seguito dell’occlusione (Rdes), il minimo di saturazione raggiunta durante l’ischemia, il rate di crescita di StO2 dopo la riperfusione (Rres) e l’area sottesa dalla curva (AUC) dopo il rilascio dell’occlusione, al disopra del valore basale. Rdes riflette il metabolismo basale del muscolo dell’eminenza tenare ma anche l’adeguatezza del microcircolo a fornire l’ossigenazione necessaria ai tessuti. Rres riflette la rapida risaturazione di ossigeno dell’emoglobina, che è indice della funzione endoteliale poiché correlata a una vasodilatazione post-ischemica e al reclutamento dei capillari. AUC invece serve per valutare la risposta iperematica a seguito della vasodilatazione locale indotta dall’ischemia.
In letteratura tutti questi parametri sono stati valutati con sensori puntuali in numerosi studi, con soggetti sani e in diverse condizioni cliniche (sepsi, anestesia, terapia intensiva, emorragie, in condizioni pre- e post- operatorie, nei fumatori, etc) per poter validare la metodica come prognostica di determinate patologie o indice di problemi circolatori.
I valori medi di tali parametri ottenuti nel presente lavoro di tesi sono confrontabili con quelli pubblicati in letteratura per soggetti sani, anche se risultano leggermente inferiori. Questo può essere spiegato considerando il fatto che il contributo del tessuto muscolare in termini di consumo di ossigeno per unità di tempo è molto più intenso rispetto a quello della pelle e del tessuto adiposo, ma il primo si trova più in profondità rispetto agli altri due. Poiché con i sensori puntuali si indaga più in profondità che con i dispositivi di imaging (circa 3 cm vs. meno di 1 cm), si può considerare valido il risultato ottenuto.
In letteratura, inoltre, viene più volte riportata l’esistenza di una correlazione tra Rres e il minimo di StO2 raggiunto durante il VOT. Nella presente tesi tale correlazione è stata valutata in 11 soggetti, risultando significativa (r2=0.555, p<0.05).
Si può ritenere, quindi, che i risultati ottenuti con il dispositivo di imaging utilizzato sono soddisfacenti e in linea con quelli pubblicati in letteratura ottenuti con i sensori puntuali. Questo dimostra che il device in dotazione può essere utilizzato per valutare correttamente l’andamento della saturazione dell'ossigeno per effettuare studi su micro- e macro- circolo. È possibile, inoltre, effettuare con successo una valutazione qualitativa degli andamenti delle concentrazioni di ossi- e deossi- emoglobina, che riflettono il fenomeno fisiologico di risposta all’ischemia. Il vantaggio rispetto ai sensori puntuali risulta evidente andando a considerare il fatto che avendo a disposizione la mappa di ossigenazione dell’intera mano si può valutare come varia l’ossigenazione stessa in siti diversi, ma soprattutto, come emerso da prove sperimentali effettuate su ratti da laboratorio, è possibile utilizzare tale dispositivo anche per applicazioni di tipo diverso.
Una destinazione tipica del dispositivo di imaging in dotazione, ad esempio, come indicato dal costruttore stesso, è quella di valutare l’evoluzione temporale di ulcere cutanee. Prendendo spunto da tale applicazione, su ratti da laboratorio è stata valutata l’evoluzione nel tempo di lesioni cutanee causate con bisturi chirurgico e con elettrobisturi nella zona del dorso. Sono state praticate manualmente le due lesioni e le rispettive aree sono state monitorate nel tempo nell’arco di 8 giorni. Nella fase iniziale la cicatrizzazione è risultata molto più rapida per la lesione praticata con elettrobisturi, mentre complessivamente la lesione praticata con bisturi chirurgico ha compiuto più velocemente il processo di guarigione. Trattandosi di una prova sperimentale su un singolo animale, tuttavia, non si può dire se questo sia generalmente valido. Questi risultati però dimostrano la possibilità di studiare l’evoluzione temporale di lesioni cutanee con il dispositivo di imaging in dotazione. Il vantaggio rispetto ad altri dispositivi di imaging che potenzialmente permettono di studiare analogamente la progressione delle aree risiede nel fatto che con la camera utilizzata è possibile valutare anche come cambia l’ossigenazione del tessuto cicatriziale nel tempo.
Si è provato, infine, ad utilizzare la camera KC103 per valutare la possibilità di studiare come cambia l’ossigenazione superficiale globale in un ratto sottoposto ad anestesia. A differenza che nell’uomo, infatti, nel quale in caso di interventi chirurgici tutti i parametri sono monitorati costantemente, quando vengono svolti studi sperimentali su animali da laboratorio di piccola taglia non si hanno informazioni su come l’ossigenazione vari nel tempo, sia nell’organismo intero che in singoli distretti. In un ratto anestetizzato intraperitonealmente è stato somministrato per inalazione Isoflurane gassoso e, variando la durata dell’inalazione, è stato verificato come cambiava l’ossigenazione globale sul dorso. È stato verificato che l’ossigenazione globale si riduce all’aumentare del tempo di inalazione, fino ad arrivare alla soppressione dell’animale per overdose di Isoflurane, con ossigenazione praticamente assente in tutto il corpo. Sono state effettuate due prove, facendo inalare tale anestetico una volta per 5 secondi e una volta per 10 secondi, e acquisendo in entrambi i casi un set di immagini distanziate di una decina di secondi l’una dall’altra. A partire da uno stesso valore di ossigenazione basale, nel primo caso il valore minimo raggiunto è più alto. Nel secondo caso, inoltre, serve più tempo per il ritorno al valore di saturazione basale. Da tali prove risulta evidente, quindi, che con il dispositivo in dotazione è possibile condurre anche indagini di questo tipo.
In conclusione, quindi, è possibile affermare che la camera KC103 della Kent Imaging Inc può essere utilizzata con successo per studiare il micro- e macro- circolo e per condurre studi per valutare l’evoluzione temporale di lesioni cutanee e la variazione della saturazione dell'ossigeno in diversi distretti corporei.
Sviluppi futuri potrebbero riguardare, per la circolazione, studi incrociati con la tecnica Flow Mediated Dilatation ad ultrasuoni per correlare i parametri rilevabili con tale metodica, considerata il gold standard per indagini sul macrocircolo, con quelli rilevati sull’eminenza tenare con la camera in dotazione. Per quanto concerne le prove sperimentali sui ratti, invece, per l’evoluzione temporale delle lesioni cutanee studi futuri di questo tipo potrebbero essere utili per poter confrontare tra loro differenti trattamenti e cure per la cicatrizzazione. Per il cambiamento di ossigenazione in seguito al’inalazione di anestetico, invece, approfondimenti in tal senso sono in corso all’Istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa, dove si sta mettendo a punto un protocollo per valutare come cambia l’ossigenazione nel tempo al variare del protocollo di anestesia utilizzato (cambiando durata, tipo e modo di somministrazione dell’anestetico). L’obiettivo è quello di valutare, in animali da laboratorio di piccola taglia, l’ossigenazione e la perfusione non solo superficiale ma anche di singoli organi, e correlare i parametri di perfusione con la temperatura corporea, il battito cardiaco, la pressione sistemica e i parametri biochimici del sangue.