ETD

• acque reflue
• antibiotic resistance genes
• antimicrobic resistance
• antimicrobico resistenza
• environmental monitoring
• geni di resistenza agli antibiotici
• method optimization
• monitoraggio ambientale
• ottimizzazione metodologica
• qPCR in tempo reale
• Real-time qPCR
• wastewater

L’antibiotico resistenza è un problema emergente a livello globale ed è riconosciuta come una delle principali minacce alla salute pubblica del XXI secolo. L’ambiente idrico rappresenta un importante reservoir di batteri antibiotico-resistenti e dei relativi geni di resistenza (antibiotic resistance genes, ARG), che vengono immessi nelle acque superficiali soprattutto attraverso lo scarico delle acque reflue. Pertanto, la ricerca degli ARG in queste matrici rappresenta uno strumento utile per valutare la diffusione del fenomeno dell’antibiotico-resistenza attraverso l’approccio dell’epidemiologia basata sulle acque reflue (wastewater-based epidemiology). È inoltre importante sottolineare come l’elevata eterogeneità delle tecniche attualmente impiegate per il monitoraggio degli ARG negli ambienti acquatici rappresenti un ostacolo significativo, rendendo necessaria la definizione di protocolli ottimizzati. Il presente elaborato di tesi si articola in due parti: nella prima è stata ottimizzata una metodologia per la ricerca degli ARG nelle acque reflue, nella seconda, la metodica risultata più efficiente è stata applicata al monitoraggio di un impianto di depurazione urbano.
Nella prima parte del lavoro, sono state confrontate diverse combinazioni di metodiche di concentrazione (centrifugazione e filtrazione) ed estrazione del DNA (Qiagen DNeasy Power Water e QIAmp DNA Micro Kit) su campioni di refluo urbano, al fine di determinare la procedura più efficiente nella rilevazione degli ARG. Ogni procedura è stata testata valutando l’efficienza di rilevazione mediante Real Time qPCR, di cinque geni di resistenza (blaCTX-M, blaKPC, vanA, qnrS e intI1) scelti per la loro rilevanza clinica e l’ampia diffusione nell’ambiente e nella popolazione. La procedura di concentrazione mediante centrifugazione ed estrazione del DNA con il kit Qiagen DNeasy Power Water è risultata la migliore, con frequenze di rilevamento del 100% (3/3) per tutti i geni. Nella seconda parte del lavoro di tesi, il protocollo analitico selezionato dalla fase precedente è stato utilizzato per il monitoraggio ambientale delle acque reflue in ingresso (non trattate) al depuratore in provincia di Pisa con frequenza mensile (gennaio 2025 - dicembre 2025). Gli ARG sono stati rilevati in più dell’80% dei campioni, con la maggior frequenza di rilevamento per intI1, qnrS e blaCTX-M e blaKPC (100%, 12/12), seguiti da vanA (91.6%, 11/12). L’analisi quantitativa ha evidenziato valori mediani di concentrazioni variabili tra i diversi geni, con valori più elevati per intI1 (3.48 × 10^4 CG/mL), seguito da qnrS (2.24 × 10^3 CG/mL), blaCTX-M (2.10 × 10^2 CG/mL), vanA (1.96 × 10^2 CG/mL), e blaKPC (9.66 CG/mL). I risultati di tale studio evidenziano come i reflui urbani in ingresso agli impianti di trattamento delle acque reflue siano un serbatoio di ARG, indicando la loro circolazione e presenza nella popolazione generale.