ETD

• bersagli redox
• inibitore di MAO-B
• ligando di TSPO
• microglia
• neuroinfiammazione
• specie reattive dell'ossigeno

La neuroinfiammazione è sempre più riconosciuta come un meccanismo centrale nella patogenesi di diverse malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Alzheimer, la malattia di Parkinson e la sclerosi multipla, in cui l’attivazione immunitaria cronica contribuisce all’insorgenza e alla progressione della malattia (Shi e Yong 2025). La microglia, principale componente dell’immunità innata del sistema nervoso centrale, svolge un ruolo fondamentale nell’avvio e nella regolazione delle risposte neuroinfiammatorie. Queste cellule presentano una notevole plasticità funzionale e fenotipica, che consente loro di rispondere dinamicamente a specifici segnali molecolari e alle condizioni del microambiente locale (Glass et al. 2010; Araújo et al. 2022). In condizioni fisiologiche, un’attivazione microgliale controllata sostiene la protezione neuronale e l’omeostasi. Al contrario, stimoli persistenti o eccessivi possono innescare risposte prolungate e disregolate, promuovendo circuiti pro-infiammatori auto-perpetuanti e aumentando il carico neurotossico (Tang e Le 2016). Sebbene le evidenze meccanicistiche dell’iperattivazione microgliale derivino principalmente da modelli animali, risulta fondamentale approfondire tali processi in sistemi umani al fine di sviluppare strategie terapeutiche con maggiore rilevanza traslazionale.
La modulazione dello stato funzionale della microglia è strettamente legata all’equilibrio redox intracellulare, in cui le specie reattive dell’ossigeno (ROS) svolgono sia ruoli metabolici sia funzioni di segnalazione in grado di influenzare programmi trascrizionali pro- e anti-infiammatori (Caruso et al. 2023; Beucher et al. 2024).
In questo contesto, due regolatori redox intracellulari stanno emergendo come possibili elementi critici per la modulazione dello stato microgliale: la proteina traslocatrice mitocondriale TSPO (Translocator Protein 18 kDa) e l’enzima monoamino ossidasi B (MAO-B). TSPO è localizzata nella membrana esterna dei mitocondri e la sua espressione aumenta nella microglia attivata, dove influenza l’attività mitocondriale, la produzione di ROS e la polarizzazione fenotipica (REF). MAO-B, anch’essa localizzata nella membrana mitocondriale esterna, è una fonte significativa di ROS citosolici derivati dal metabolismo delle amine biogene e contribuisce alla generazione di segnali redox (Liu et al. 2023).
Lo scopo della presente tesi è stato quello di caratterizzare in maniera integrata il ruolo dei segnali redox nella modulazione dell’attivazione microgliale umana sottoposta a un intenso stimolo pro-infiammatorio e di valutare se la modulazione combinata di due regolatori redox endogeni, TSPO (Translocator Protein 18 kDa) e MAO-B (Monoamine Oxidase B), possa influenzare lo stato fenotipico della microglia verso un potenziale profilo funzionale neuroprotettivo. Questo approccio sperimentale ha previsto l’impiego di composti di nuova generazione: ER93, un ligando di TSPO ad alta affinità, e PAD264, un inibitore competitivo altamente selettivo di MAO-B.
Per caratterizzare sistematicamente l’attivazione microgliale in risposta a stimoli infiammatori intensi, è stato utilizzato un modello cellulare umano basato sulla linea C20, ampiamente validata come sistema affidabile per lo studio della microglia (Angeloni et al. 2023; Davis et al. 2017; Garcia-Mesa et al. 2017; Germelli et al. 2025). In queste cellule, a seguito del trattamento con un’elevata concentrazione di IL-1β (50 ng/mL), sono stati valutati nel tempo i seguenti parametri: livelli di ROS mitocondriali e citosolici; livelli dell’mRNA di NF-κB e dei suoi geni pro-infiammatori canonici (IL-6, IL-1β, NOX2); marcatori molecolari della fusione e fissione mitocondriale (Mfn-1, Mfn-2, OPA-1, Drp-1, Fis-1); interleuchine anti-infiammatorie (IL-4, IL-10); mediatori omeostatici (CX3CR1, TGF-β); nonché l’attività metabolica globale e proliferativa. Per valutare l’impatto del trattamento farmacologico sullo stato redox e pro-infiammatorio indotto da IL-1β, le cellule C20 sono state pretrattate con i ligandi di nuova sintesi alla concentrazione di 1 µM. Considerando i diversi ruoli funzionali dei due target biologici in studio, ciascun composto è stato inizialmente valutato separatamente. Successivamente, è stato valutato anche il trattamento combinato con ER93 e PAD264 per determinare se la modulazione simultanea di due vie distinte potesse determinare un effetto complessivo potenziato rispetto ai trattamenti con il singolo composto.
I risultati ottenuti hanno evidenziato che l’IL-1β a 50 ng/mL induce un aumento precoce dei ROS mitocondriali, un incremento ritardato dei ROS citosolici, una compromissione dei meccanismi adattativi mitocondriali, una robusta induzione dei mediatori pro-infiammatori e l’assenza di una modulazione trascrizionale di IL-4, IL-10 e CX3CR1, e una marcata riduzione dell’espressione di TGF-β, suggerendo l’acquisizione di un fenotipo microgliale pro-infiammatorio disregolato ed eccessivo.
La modulazione di TSPO mediante il ligando ER93 ha ridotto specificamente i ROS mitocondriali e favorito il recupero dell’omeostasi mitocondriale, limitando parzialmente l’attivazione dei geni pro-infiammatori NF-κB-dipendenti, come suggerito dalla dowregolazione dell’espressione genica di IL-1β e NOX2. L’inibizione di MAO-B tramite PAD264 ha ridotto prevalentemente i ROS citosolici e promosso l’attivazione dei geni anti-infiammatori e omeostatici, favorendo un fenotipo regolatorio senza sopprimere completamente l’attività pro-infiammatoria. Il trattamento combinato ha integrato gli effetti complementari dei due ligandi, riducendo i ROS mitocondriali e citosolici, limitando l’induzione di NOX2, sopprimendo i programmi pro-infiammatori e favorendo l’espressione di segnali anti-infiammatori e pro-risolutivi. Le misurazioni MTT hanno mostrato che nessuno dei trattamenti, singolo o combinato, alterava significativamente l’attività metabolica globale, suggerendo che la capacità metabolica e la vitalità/proliferazione della microglia sono preservate.
Questa sperimentazione fornisce evidenze rilevanti sul ruolo dello stato redox nell’amplificazione delle risposte dipendenti da NF-κB nella microglia umana esposta ad alte concentrazioni di IL-1β, identificando TSPO 18 kDa e MAO-B come target redox distinti ma complementari, capaci di contrastare l’iperattivazione microgliale e di facilitare il ripristino di programmi anti-infiammatori, pro-risolutivi e neuroprotettivi. Tale profilo risulta particolarmente rilevante nella neuroinfiammazione cronica, in cui la condizione patologica non deriva dall’attivazione microgliale acuta in sé, bensì dall’incapacità di risolvere la risposta neuroinfiammatoria nel tempo.