• interferenza RNAi
• manipolazione genica

L’interferenza dell’RNA è un meccanismo regolatorio in cui piccole molecole di RNA a doppio filamento inducono un controllo omologia-dipendente dell’espressione genica. Si tratta di un meccanismo normalmente presente nelle cellule eucariotiche che è stato sviluppato nel trattamento di patologie umane per reprimere l’espressione di sequenze conosciute alla base dello stato patologico. E’ stato applicato con successo nel trattamento della AMD e RSV ed è ancora in fase di studio nei disordini neurodegenerativi e nel cancro. I migliori risultati sono stati ottenuti attraverso metodi di veicolazione virale anche se ci sono diversi effetti collaterali come la risposta dell’interferone.
L’interferenza dell’RNA nelle cellule di mammifero avviene attraverso diversi meccanismi : il primo è il silenziamento genico post trascrizionale di un doppio filamento di RNA , siRNA di 21 nucleotidi, che una volta formato viene legato dal Dicer, e caricato nel RISC complesso di silenziamento indotto dall’RNA, a cui è associata una endonucleasi che taglia e degrada il filamento passenger formando un unico filamento che va a legare la sequenza perfettamente complementare sull’mRNA. Il legame avviene negli ORF sequenze che successivamente vengono degradate. Il secondo è la via dei miRNA, doppi filamenti di 22 nucleotidi, che effettuano sempre un silenziamento genico post trascrizionale. All’inizio la Pol II trascrive il trascritto primario che viene processato dall’enzima Drosha in una struttura di 70 nucleotidi definita precursore, che viene legata da una proteina di membrana che la trasferisce nel citoplasma. Qui viene legata da Dicer e processato in una struttura finale di 22 nucleotidi nel RISC. In questo caso esiste una non perfetta complementarietà per cui interviene una elicasi che svolge e rilascia il filamento passenger. A quel punto l’miRNA si lega all’mRNA nelle regioni 3’ non tradotte inducendo il silenziamento con successiva degradazione. Il terzo è il silenziamento genico trascrizionale che avviene con siRNA di 21 nucleotidi che agiscono sul materiale genetico provocando variazioni nella cromatina che influenzano la trascrizione anche se i meccanismi non sono ancora ben conosciuti.
Per la veicolazione sono stati realizzati diversi interventi per stabilizzare gli RNA. Vengono usati RNA interferenti con 2 nucleotidi in più all’estremità 3’ che favoriscono il riconoscimento del Dicer, o con modifiche chimiche sui filamenti che aumentano la potenza del silenziamento. Oppure vengono introdotti all’interno di particelle liposomiali o associati al colesterolo che facilita l’uptake cellulare. Questi sono metodi non selettivi, invece la formazione di chimere con siRNA ed aptameri, o l’inserimento all’interno di nanoparticelle o il legame ad anticorpi sono metodi selettivi perché sulla superficie ci sono ligandi per specifici targets cellulari. Nei metodi di veicolazione virali si parte dal DNA virale in cui vengono inserite le sequenze geniche degli RNA interferenti. Nel momento in cui il virus va ad infettare una cellula ospite rilascerà anche le informazioni genetiche degli RNA interferenti.
Le principali terapie basate sull’ interferenza dell’RNA sono:
AMD- I migliori risultati sono stati ottenuti con siRNA introdotti attraverso iniezioni intravitreali dirette che hanno permesso di ridurre l’espressione di VEGF.
EPATITE B- è stato possibile inibire la replicazione virale prevenendo la risposta dell’interferone attraverso shRNA veicolati da nanoparticelle e SNALP.
RSV- sono stati utilizzati siRNA veicolati da nanoparticelle attraverso la via inalatoria che hanno portato inibizione della replicazione virale nel topo e nell’uomo.
HIV- è stata ottenuta l’inibizione dell’infezione utilizzando vettori lentivirali veicolanti shRNA diretti contro cofattori cellulari che permettono l’ingresso del virus.
CANCRO- i principali bersagli sono oncogeni sovra espressi e in alcuni casi, attraverso siRNA veicolati da nanoparticelle è stata ottenuta una riduzione delle dimensioni del tumore.
ALS-è causata da mutazioni del gene che codifica per la superossido dismutasi verso cui è stato possibile creare siRNA in grado di provocarne il silenzia mento.
Questa tecnica è notevolmente interessante anche se ci sono diverse problematiche da risolvere come:
-migliorare il rilascio sistemico
-ridurre la risposta dell’interferone
-approfondire il silenziamento genico trascrizionale
-verificare gli effetti dovuti ad un uso prolungato
I prossimi studi sono indirizzati ad ampliare le applicazioni del trattamento con l’interferenza dell’RNA.