ETD

• agarose
• bioactive materials
• piezoelectric materials
• sensorineural hearing loss
• surface functionalization

This thesis presents the development and characterization of bioactive materials designed to improve the biocompatibility and functionality of piezoelectric cochlear implants for the treatment of sensorineural hearing loss (SNHL). SNHL is hearing disorder with high social impact caused by damage to cochlear structures devoted to signal transduction and conduction, namely hair cells (about 90% of cases) or acoustic neurons (about 10% of cases). Currently, cochlear implants represent the most effective therapeutic solution for severe to profound SNHL. However, conventional devices still present some limitations, mainly related to their reliance on external and internal magnetic components. To address this challenge, piezoelectric materials in the form of nanofibers, such as poly(vinylidene fluoride-co-hexafluoropropylene) (PVDF-HFP) and polyacrylonitrile (PAN), including those in a Janus configuration, could offer an innovative solution. Thanks to their ability to convert mechanical deformation into an electric charge, they could harness the cochlear natural vibrations to autonomously stimulate auditory neurons, thereby eliminating the need for an external power source. However, challenges still exist, including the obtainment of an intimate contact between the inserted piezoelectric elements and the basilar membrane of the cochlea, which would allow an en bloc vibration of them with the basilar membrane and the perfect local transfer of the generated electric charges to the afferent neurons.
This thesis work aimed at investigating an efficient strategy to deliver the piezoelectric nanofibers to the basilar membrane and improve their adhesion, by developing (1) a strategy for nanofiber functionalization able to promote their adhesion to the basilar membrane, and (2) a biodegradable and bioactive fiber carrier to help positioning the fibers at their expected location.
Aim 1: The hydrophobic nature of PVDF-HFP and PAN nanofibers, developed in previous studies, as well as the lack of cell adhesion sites limit their integration with cochlear tissues. The functionalization of the nanofibers was carried out by depositing polydopamine (PDA) using three different approaches: (i) direct deposition, (ii) pretreatment with NaOH followed by PDA, and (iii) oxygen plasma pretreatment followed by PDA. The pretreatments are intended to increase the surface reactivity of the nanofibers and promote the adhesion of the PDA nanofilm. The effectiveness of the oxygen plasma treatment was verified through wettability tests, which showed an increase in hydrophilicity, and through Attenuated Total Reflectance Fourier-transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR), which confirmed the introduction of new functional groups on the surface of the nanofibers. The amount of PDA was assessed quantitatively using a colorimetric bicinchoninic acid (BCA) assay, which allowed us to identify the most effective functionalization strategy for each type of fiber. The subsequent deposition of the PDA nanofilm was also confirmed by ATR-FTIR. Contact angle measurements further showed an increase in hydrophilicity in most of the functionalized nanofibers. In the ear organ, biocompatibility has shown to play a pivotal role due to scarce biomaterials acceptance. Therefore, otocompatibility of both treated and untreated nanofibers was evaluated in vitro through a cell viability test MTS assay (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) using OC-k3 (Organ of Corti-derived, immortalized epithelial) cells, showing no cytotoxic effects. Furthermore, 4',6-diamidino-2 phenylindole (DAPI staining) was performed to assess cell morphology on the nanofibrous substrates, confirming proper cell adhesion and distribution. Aim 2: A biodegradable hydrogel, also used as a drug delivery system, was developed as a carrier for fiber insertion and placement. It features a T-shaped cross section geometry and is composed of a agarose blended with sodium alginate, cross-linked with calcium ions, obtained by casting into a resin mold manufactured using masked stereolithography (MSLA 3D) printing. Various formulations of agarose and agarose/alginate were evaluated to identify the most suitable one. The T-shape cross section was chosen to allow for the positioning of the nanofibers within the tympanic scale, while ensuring the concomitant presence of perilymph, necessary for the hydrogel biodegradation. The structural stability and biodegradation profile of the hydrogel were evaluated using a simulate body fluid, i.e., an artificial perilymph. This allowed the identification of the most suitable formulation, namely the agarose/sodium alginate-based hydrogel, which exhibited the best balance between mechanical stability and degradation kinetics, to be selected for the controlled release of three pharmacological agents (i.e., curcumin, dexamethasone, and BDNF). The in vitro otocompatibility of curcumin, dexamethasone, and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) was tested on SH-SY5Y (human neuroblastoma-derived) cells, revealing no significant cytotoxic effects at the selected concentrations. The release of curcumin from the hydrogel, assessed via UV-Vis spectrophotometry, showed an initial burst release followed by a gradual and sustained profile over approximately two weeks, primarily governed by a diffusive mechanism, consistent with the degradation times.
Dexamethasone release, evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC) analysis, exhibited an initial burst followed by a sustained release over one week. Kinetic modeling indicated a predominantly zero-order behavior, with contribution from diffusion-controlled mechanisms.
Overall, this work highlights the potential of an innovative approach that combines functionalized piezoelectric nanofibers with a biodegradable hydrogel carrier fabricated via mold casting. The result is a multifunctional platform designed for inner ear dysfunction treatment. This integrated system can provide both self-powered electrical stimulation and controlled drug release, offering a promising strategy to improve interaction with the dendrites of auditory neurons and enhance the effectiveness of next-generation cochlear implants. Taken together, these findings represent a significant contribution to the goals of the PROMISE project (PiezOelectric Regenerative Interfaces for Multimodal Stimulation and dElivery), confirming the key role of tailor-made biomaterials in the development of advanced acoustic prostheses.

Questa tesi presenta lo sviluppo e la caratterizzazione di materiali bioattivi progettati per migliorare la biocompatibilità e la funzionalità di impianti cocleari piezoelettrici per il trattamento della perdita uditiva neurosensoriale (SNHL). La SNHL è un disturbo dell’udito con un elevato impatto sociale, causato da danni alle strutture cocleari deputate alla trasduzione e conduzione del segnale, ovvero le cellule ciliate (circa il 90% dei casi) o i neuroni acustici (circa il 10% dei casi). Attualmente, gli impianti cocleari rappresentano la soluzione terapeutica più efficace per la SNHL grave o profonda. Tuttavia, i dispositivi convenzionali presentano ancora alcune limitazioni, principalmente legate alla presenza di componenti magnetici esterni e interni.
Per affrontare questa sfida, materiali piezoelettrici sotto forma di nanofibre, come il poli(vinilidenfluoruro-co-esafluoropropilene) (PVDF-HFP) e il poliacrilonitrile (PAN), inclusi quelli in configurazione Janus, potrebbero offrire una soluzione innovativa. Grazie alla loro capacità di convertire la deformazione meccanica in carica elettrica, essi potrebbero sfruttare le vibrazioni naturali della coclea per stimolare autonomamente i neuroni uditivi, eliminando così la necessità di una fonte di alimentazione esterna. Tuttavia, permangono alcune criticità, tra cui l’ottenimento di un contatto intimo tra gli elementi piezoelettrici inseriti e la membrana basilare della coclea, che consentirebbe una vibrazione “en bloc” con essa e un trasferimento locale ottimale delle cariche elettriche generate ai neuroni afferenti.
Questo lavoro di tesi ha avuto come obiettivo l’indagine di una strategia efficiente per veicolare le nanofibre piezoelettriche alla membrana basilare e migliorarne l’adesione, attraverso lo sviluppo di: (1) una strategia di funzionalizzazione delle nanofibre in grado di promuoverne l’adesione alla membrana basilare, e (2) un carrier fibroso biodegradabile e bioattivo per facilitare il posizionamento delle fibre nella sede desiderata.
Obiettivo 1: La natura idrofobica delle nanofibre di PVDF-HFP e PAN, sviluppate in studi precedenti, così come la mancanza di siti di adesione cellulare, ne limita l’integrazione con i tessuti cocleari. La funzionalizzazione delle nanofibre è stata effettuata mediante deposizione di polidopamina (PDA) utilizzando tre diversi approcci: (i) deposizione diretta, (ii) pretrattamento con NaOH seguito da PDA, e (iii) pretrattamento con plasma di ossigeno seguito da PDA. I pretrattamenti sono volti ad aumentare la reattività superficiale delle nanofibre e a favorire l’adesione del nanofilm di PDA. L’efficacia del trattamento con plasma di ossigeno è stata verificata tramite test di bagnabilità, che hanno mostrato un aumento dell’idrofilicità, e mediante spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier in riflettanza totale attenuata (ATR-FTIR), che ha confermato l’introduzione di nuovi gruppi funzionali sulla superficie delle nanofibre.
La quantità di PDA è stata valutata quantitativamente mediante un saggio colorimetrico con acido bicinconinico (BCA), che ha permesso di identificare la strategia di funzionalizzazione più efficace per ciascun tipo di fibra. La successiva deposizione del nanofilm di PDA è stata ulteriormente confermata tramite ATR-FTIR. Le misure dell’angolo di contatto hanno inoltre evidenziato un aumento dell’idrofilicità nella maggior parte delle nanofibre funzionalizzate. Nell’organo dell’udito, la biocompatibilità gioca un ruolo cruciale a causa della limitata accettazione dei biomateriali. Pertanto, l’otocompatibilità delle nanofibre, sia trattate che non trattate, è stata valutata in vitro mediante test di vitalità cellulare (saggio MTS) utilizzando cellule OC-k3 (cellule epiteliali immortalizzate derivate dall’organo del Corti), mostrando assenza di effetti citotossici. Inoltre, è stata eseguita colorazione con DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindolo) per valutare la morfologia cellulare sui substrati nanofibrosi, confermando una corretta adesione e distribuzione cellulare.
Obiettivo 2: È stato sviluppato un idrogel biodegradabile, utilizzato anche come sistema di rilascio di farmaci, come supporto per l’inserimento e il posizionamento delle fibre. Esso presenta una geometria a sezione trasversale a forma di T ed è composto da agarosio miscelato con alginato di sodio, reticolato con ioni calcio, ottenuto mediante colata in uno stampo in resina realizzato tramite stampa 3D MSLA (masked stereolithography). Sono state valutate diverse formulazioni di agarosio e agarosio/alginato per identificare quella più adatta.
La sezione a T è stata scelta per consentire il posizionamento delle nanofibre nella scala timpanica, garantendo al contempo la presenza di perilinfa, necessaria per la biodegradazione dell’idrogel. La stabilità strutturale e il profilo di biodegradazione dell’idrogel sono stati valutati utilizzando un fluido corporeo simulato, ovvero una perilinfa artificiale. Questo ha permesso di identificare la formulazione più idonea, cioè l’idrogel a base di agarosio/alginato di sodio, che ha mostrato il miglior equilibrio tra stabilità meccanica e cinetica di degradazione, risultando adatto per il rilascio controllato di tre agenti farmacologici (curcumina, desametasone e BDNF).
L’otocompatibilità in vitro di curcumina, desametasone e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) è stata testata su cellule SH-SY5Y (derivate da neuroblastoma umano), evidenziando l’assenza di effetti citotossici significativi alle concentrazioni selezionate. Il rilascio della curcumina dall’idrogel, valutato tramite spettrofotometria UV-Vis, ha mostrato un rilascio iniziale rapido seguito da un profilo graduale e sostenuto per circa due settimane, governato principalmente da un meccanismo diffusivo, coerente con i tempi di degradazione. Il rilascio del desametasone, valutato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), ha mostrato un rilascio iniziale rapido seguito da un rilascio sostenuto per una settimana. La modellazione cinetica ha indicato un comportamento prevalentemente di ordine zero, con contributi da meccanismi controllati dalla diffusione.
Nel complesso, questo lavoro evidenzia il potenziale di un approccio innovativo che combina nanofibre piezoelettriche funzionalizzate con un carrier idrogel biodegradabile ottenuto mediante stampaggio. Il risultato è una piattaforma multifunzionale progettata per il trattamento delle disfunzioni dell’orecchio interno. Questo sistema integrato può fornire sia stimolazione elettrica autoalimentata sia rilascio controllato di farmaci, offrendo una strategia promettente per migliorare l’interazione con i dendriti dei neuroni uditivi e aumentare l’efficacia degli impianti cocleari di nuova generazione.
Nel loro insieme, questi risultati rappresentano un contributo significativo agli obiettivi del progetto PROMISE (PiezOelectric Regenerative Interfaces for Multimodal Stimulation and dElivery), confermando il ruolo chiave dei biomateriali su misura nello sviluppo di protesi acustiche avanzate.