ETD

• acque reflue
• antimicrobic-resistance
• antimicrobico-resistenza
• Enterococcus
• groEL
• vanA
• vancomycin-resistant enterococci
• wastewater
• wastewater-based epidemiology

Antimicrobial resistance (AMR) represents one of the major emerging threats to global public health and requires integrated surveillance tools within a One Health framework. In this context, wastewater-based epidemiology (WBE) has emerged as a useful approach for monitoring the circulation of resistant microorganisms and their associated genetic determinants, as well as for comparing them across populations served by different sewer catchments. This study evaluated the prevalence of vancomycin-resistant enterococci (VRE) in wastewater representative of three urban population subgroups: the general population, a young population, and a hospitalized population. Particular attention was paid to Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis, two clinically relevant species, and to the vanA gene, the main genetic determinant of vancomycin resistance.

Sampling was carried out in three different settings within the same city: influent wastewater from an urban wastewater treatment plant, wastewater from a university building, and hospital wastewater collected upstream of preliminary treatment. Samples were analyzed using an integrated culture-dependent and culture-independent approach. Culture-based analyses included the isolation and quantification of total enterococci and VRE on Slanetz & Bartley agar, respectively in the absence and presence of vancomycin. Isolates were identified at the species level by species-specific PCR targeting the groEL gene, and vancomycin-resistant isolates were further screened for the presence of the vanA gene. In addition, a subset of resistant E. faecium isolates underwent phylogenetic analysis through sequencing of a portion of the groESL locus. In parallel, vanA, intI1, and ermB were quantified in metagenomic DNA extracted from wastewater samples by dPCR and qPCR.

The results showed that the total enterococcal load was comparable across the three population subgroups, whereas significant differences emerged in the vancomycin-resistant fraction. The hospitalized population showed the highest concentration and percentage prevalence of VRE, the general population showed intermediate values, and the young population displayed levels close to zero. In the hospitalized and general population subgroups, all isolated VRE belonged to E. faecium and were positive for vanA, whereas in the young population the few phenotypically resistant isolates were negative for this gene. Phylogenetic analysis revealed that E. faecium isolates from the hospitalized and general population subgroups clustered within clade A, which is frequently associated with clinical settings, whereas the few isolates from the young population clustered within clade B, more typically associated with commensal or community strains. Metagenomic analyses confirmed the observed gradient: vanA and intI1 were significantly more abundant in the hospital setting, while ermB showed a more widespread distribution across the groups.

These findings indicate that vancomycin resistance in enterococci is strongly concentrated in the hospital setting, more limited in the general population, and marginal in the young population, confirming the role of healthcare settings as major hotspots for the selection of VRE.

Overall, this study highlights how WBE, when integrated with culture-based, molecular, and phylogenetic approaches, may represent an effective tool for detecting epidemiological differences among population subgroups and for supporting AMR surveillance within a One Health framework.

L’antimicrobico-resistenza (AMR) rappresenta una delle principali minacce emergenti per la salute pubblica globale e richiede strumenti di sorveglianza integrati in ottica One Health. In questo contesto, la Wastewater-Based Epidemiology (WBE) si configura come un approccio utile per monitorare la circolazione di microrganismi resistenti e dei relativi determinanti genetici e per confrontarli all’interno di popolazioni afferenti a differenti bacini fognari. Il presente studio ha valutato la prevalenza degli enterococchi vancomicina-resistenti (VRE) in reflui rappresentativi di tre sottogruppi di popolazione urbana: popolazione generale, popolazione giovane e popolazione ospedalizzata. In particolare, l’attenzione è stata rivolta a Enterococcus faecium ed Enterococcus faecalis, specie di rilevanza clinica, e al gene vanA, principale determinante genetico della resistenza alla vancomicina.
Il campionamento è stato condotto in tre differenti setting della stessa città: reflui in ingresso a un depuratore urbano, reflui provenienti da un edificio universitario e reflui ospedalieri prelevati a monte del pre-trattamento. I campioni sono stati analizzati mediante un approccio integrato coltura-dipendente e coltura-indipendente. Le analisi colturali hanno previsto l’isolamento e la quantificazione degli enterococchi totali e dei VRE su terreno Slanetz & Bartley, rispettivamente in assenza e in presenza di vancomicina. Gli isolati sono stati identificati a livello di specie tramite PCR specie-specifica basata sul gene groEL e, per i ceppi resistenti, è stata ricercata la presenza del gene vanA. Un sottogruppo di isolati di E. faecium resistenti è stato inoltre sottoposto ad analisi filogenetica mediante sequenziamento di una porzione del locus groESL. Parallelamente, sul DNA metagenomico estratto dai campioni sono stati quantificati vanA, intI1 ed ermB mediante dPCR e qPCR.
I risultati hanno mostrato che il carico totale di enterococchi era comparabile nei tre sottogruppi, mentre differenze significative emergevano nella frazione resistente alla vancomicina. La popolazione ospedalizzata presentava infatti la maggiore concentrazione e prevalenza percentuale di VRE, la popolazione generale valori intermedi e la popolazione giovane livelli prossimi allo zero. Nei sottogruppi ospedaliero e generale, la totalità dei VRE isolati apparteneva a E. faecium ed era positiva per vanA, mentre nella popolazione giovane i pochi isolati fenotipicamente resistenti risultavano negativi per tale gene. L’analisi filogenetica ha evidenziato che gli isolati di E. faecium provenienti dai sottogruppi ospedaliero e generale clusterizzavano con il clade A, frequentemente associato a contesti clinici, mentre i pochi isolati provenienti dalla popolazione giovane si collocavano nel clade B, più tipicamente associato a ceppi commensali o comunitari. Le analisi metagenomiche hanno confermato il gradiente osservato: vanA e intI1 risultavano significativamente più abbondanti nel setting ospedaliero, mentre ermB mostrava una distribuzione più trasversale tra i gruppi.
I risultati indicano che la resistenza alla vancomicina negli enterococchi è fortemente concentrata nel setting ospedaliero, più contenuta nella popolazione generale e marginale nella popolazione giovane, confermando il ruolo dei contesti assistenziali come principali hotspot di selezione e diffusione di VRE.
Nel complesso, lo studio evidenzia come la WBE, integrata con approcci colturali, molecolari e filogenetici, possa rappresentare uno strumento efficace per intercettare differenze epidemiologiche tra sottopopolazioni e per supportare la sorveglianza dell’AMR in ottica One Health.