logo SBA

ETD

Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-03072017-183033


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
PETRI, ELISA
URN
etd-03072017-183033
Titolo
Leucodistrofia a cellule globoidi: sviluppo di una nuova terapia enzimatica sostitutiva mediata da nanoparticelle
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI
Relatori
relatore Dott. Cecchini, Marco
Parole chiave
  • attività enzimatica
  • BEE
  • FPLC
  • GALC
  • GLD
  • Krabbe
  • Leucodistrofia a cellule globoidi
  • LSD
  • Malattia da accumulo lisosomiale
  • nanoparticelle
  • NP
  • PLGA
  • purificazione proteina
  • terapia enzimatica sostitutiva
Data inizio appello
06/04/2017
Consultabilità
Completa
Riassunto
La leucodistrofia a cellule globoidi (GLD), conosciuta anche come malattia di Krabbe, è una malattia autosomica recessiva neurodegenerativa, causata dal deficit funzionale dell’enzima lisosomiale galattosilceramidasi (GALC). Questa malattia ha un’incidenza mondiale di mortalità di 1/100.000, e la forma più comune è quella infantile (circa 85%). Il deficit di GALC induce molteplici cambiamenti metabolici intracellulari, tra questi il più importante da eviden-ziare è l’accumulo di psicosina (PSY) nelle cellule del sistema del nervoso che può portare all’apoptosi delle cellule di Schwann e degli oligodendrociti provocando la demielinizzazione del sistema nervoso centrale e periferico.
Lo scopo di questa tesi è la messa a punto di una terapia enzimatica sostitutiva (ERT) mediata da un nanovettore come cura effettiva per la GLD, poiché attualmente sono disponibili solo trattamenti sintomatici o di supporto. La strategia nanotecnologica è necessaria in quanto il solo enzima, di circa 80 KDa, somministrato per via sistemica non riesce ad attraversare la barriera ematoencefalica (BEE), in quanto essa ha la funzione di bloccare la traslocazione delle proteine ingombranti, impedendo così al GALC di arrivare al sistema nervoso centrale.
Il primo passo del lavoro in laboratorio è stato mettere a punto un protocollo per la purificazione di GALC murino ricombinante (rmGALC), rilasciato nel terreno di coltura da cellule HEK293T modificate geneticamente in modo che esprimano GALC con un tag di istidina. Per isolare il GALC da tutto il contenuto proteico del terreno di coltura, è stata utilizzata la tecnica cromatografica di affinità con resina al Nichel (Ni), e nello specifico i primi passaggi di purificazione tramite Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)ed i successivi passaggi tramite cromatografia per gravità. Ottimizzata la purificazione, il passo successivo è stato incapsulare rmGALC in nanoparticelle (NPs) polimeri che composte dal copolimero acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA), approvato dalla Food and Drug Administration (FDA), e decorate con glicopeptide sintetico (g7) per favorire l’endocitosi cellulare. Le NPs con rmGALC sono state preparate con una doppia emulsione tramite sonicazione, di due fasi: una fase acquosa contenente l’enzima e una fase oleosa contenente il copolimero, e successiva evaporazione del solvente oleoso in modo da avere nella sola fase acquosa le GALC-PLGA NPs. A questo punto è importante verifi-care tramite stress test che l’enzima mantenga la sua attività enzimatica du-rante l’intero processo di incapsulamento. Per questo motivo è stato utilizza-to il saggio enzimatico utilizzando il substrato 4-Metilumbelliferil β-D-galactopiranoside (4-MU-βGAL) specifico per il GALC. Il terzo ed ultimo pas-so è stato testare in vitro l’efficienza di veicolazione delle nanoparticelle ed il rilascio del GALC in cellula. Per questi test sono state utilizzate linee primarie di fibroblasti murini, estratti da topi wilde-type (WT) e twitcher (TWI), il mo-dello murino spontaneo di GLD. Fibroblasti WT e TWI sono stati trattati con GALC-PLGA-NPs oppure con solo enzima per 24h e 48 h. Alla fine di ogni trattamento è stata valutata l’attività intracellulare di GALC su lisati cellulari. I risultati ottenuti evidenziano un aumento dell’attività enzimatica nei fibro-blasti TWI trattati con GALC-PLGA-NPs, in quanto viene rispristinata l’attività enzimatica di circa il 30% rispetto ai fibroblasti WT. Ciò non è stato eviden-ziato nei fibroblasti TWI trattati con il solo enzima libero.
File