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• crispr/cas9
• sotos
• nsd1
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I “disturbi dello spettro autistico” (ASD, Autistic Spectrum Disorders) indicano un gruppo eterogeneo di disordini del neuro-sviluppo, che caratterizzano clinicamente pazienti con gravi compromissioni nello sviluppo cognitivo, sociale e comunicativo. L’eterogeneità della malattia è un riflesso della sua eziologia multifattoriale; infatti, sono stati individuati come fattori causali o predisponenti alterazioni genetiche, epigenetiche e cause ambientali.

Tra i geni candidati, la cui alterazione sarebbe responsabile degli ADS, troviamo NSD1 (Nuclear receptor SET Domain-containing 1) che mappa nell’uomo sul cromosoma 5 e codifica per una proteina con attività N-metiltransferasica di mono- e di-metilazione a livello del residuo di lisina 36 dell’istone H3 (H3K36), tale modifica regola la trascrizione e i processi co-trascrizionali in maniera attivante o inibente, a seconda dell’ambiente epigenetico circostante, oltre che dalla posizione nell’ambito della sequenza del gene, svolgendo così un ruolo di regolatore trascrizionale bifunzionale. L’attività metiltrasferasica di NSD1 risulta conservata anche in altri Metazoi, tale proteina appartiene alla famiglia filogeneticamente distinta delle lisina-HMTasi NSD, di cui fanno parte anche NSD2 e NSD3, ed è espressa in diversi distretti tissutali, tra cui il sistema nervoso centrale, sia fetale sia adulto.

Aploinsufficienza nel gene NSD1, si rileva con elevata frequenza in soggetti affetti da Sindrome di Sotos (SS), la cui incidenza stimata risulta di 1 su 14.000 bambini nati vivi. Il quadro clinico è contraddistinto da un’accelerata crescita prenatale e infantile, accelerata crescita ossea, macrocefalia, caratteristici tratti fisionomici del viso, disabilità intellettiva e tratti autistici del comportamento.

Lo scopo del progetto di tesi è di studiare l’effetto della perdita di funzione di NSD1, con particolare riferimento allo sviluppo neuronale e craniofacciale, utilizzando come modello il teleosteo Danio rerio (zebrafish). A causa di un evento di duplicazione genomica specifica dei teleostei, in zebrafish si riconoscono due ortologhi al gene umano NSD1: nsd1a e nsd1b, i quali codificano per proteine caratterizzate da un elevato indice di omologia con la proteina umana NSD1 superiore all’80%.

Al fine di creare e caratterizzare un modello con perdita di funzione per i geni ortologhi di NSD1 in zebrafish è stata impiegata la tecnica di gene editing CRISPR/Cas9, in grado di operare mutagenesi mirata, rapida e a basso costo, attraverso la micro-iniezione nello zigote del complesso ribonucleoproteico composto da RNA-guida (crRNA:tracrRNA) ed endonucleasi Cas9.

Per quanto riguarda l’ortologo, nsd1b, è stato possibile validare mediante “taglio in vitro”, il sistema CRISPR-Cas9 contro il gene nsd1b, con la prospettiva futura di validare tale sistema in vivo, tramite la microiniezione in zebrafish allo stadio di zigote e la valutazione dell’avvenuto gene editing mediante tecnica HRM (High Resolution Melting). Mentre, riguardo l’altro ortologo nsd1a, erano già presenti, nel laboratorio ospitante, tre linee adulte mutanti nsd1a: Δ5, Δ7 e Δ11, grazie alle quali ho effettuato studi di tipo molecolare, morfometrico e comportamentale.

Incroci mirati fra adulti della generazione F1 nsd1a Δ5 e Δ11 (incross) portatori di una medesima mutazione, nello specifico di una delezione rispettivamente di 5 e 11 nucleotidi responsabile della LoF (Loss of Function) del gene, hanno permesso di dare origine alla popolazione F2. Sulla progenie così ottenuta sono state condotte ulteriori analisi di carattere molecolare e morfologico volte a confermare la specifica mutazione trasmessa e a rilevare alterazioni nella vitalità e nello sviluppo globale degli individui nelle tre condizioni genotipiche nsd1a per ogni linea mutante. Tramite analisi craniofacciali effettuate su larve eterozigoti per nsd1a Δ11, si è osservata la presenza di malformazioni craniofacciali, in linea con quanto osservato nei pazienti affetti dalla Sindrome di Sotos.

Una volta identificati i mutanti eterozigoti, è stato possibile valutare alcuni aspetti comportamentali tramite l’Open Field test, mettendo in evidenza assenza di differenze significative tra eterozigoti e wild type.

In parallelo, è stato messo a punto un protocollo per modulare i livelli di specifici mRNA nelle fasi precoci dello sviluppo embrionale di zebrafish, utilizzando la tecnica basata sulla proteina Cas13d, un RNA endonucleasi che permette taglio e successiva degradazione dell’mRNA, riconosciuto grazie all’utilizzo di un RNA-guida. In particolare, è stata sintetizzata e purificata sia la proteina ricombinante Cas13d, sia l’mRNA Cas13d sintetizzato in vitro a partire da un plasmide. Si è analizzata, successivamente, l’efficienza di quest’ultimo, valutandone l’effetto della microiniezione in zigoti di zebrafish, insieme a due RNA-guida diretti contro il gene tbxta, per verificarne l’efficienza del sistema. Con lo scopo finale di applicare tale tecnica di knock down ai nostri geni di interesse, quali nsd1a e nsd1b. Tale approccio sperimentale può permettere di caratterizzare l’effetto della ridotta espressione dei suddetti geni sullo sviluppo embrionale di zebrafish. L’organismo modello zebrafish dimostra del potenziale per lo sviluppo futuro e può essere utilizzato per studi di modificazione epigenetica relativi al processo di invecchiamento fisiologico, o studi relativi al mantenimento dell'integrità del genoma, ma anche come piattaforma preclinica per esperimenti oncologici.



The "Autistic Spectrum Disorders" (ASD) indicate a heterogeneous group of neuro-developmental diseases, clinically characterized by severe impairments in cognitive, social and communicative development. The heterogeneity of these diseases is due to their multifactorial etiology; as a matter of fact, genetic, epigenetic and environmental factors have been identified as predisposing or direct causes of the diseases. Among the candidate genes, whose alteration would be responsible for ADS, NSD1 (Nuclear receptor SET Domain-containing 1) has been identified. It maps in humans on chromosome 5 and encodes for a protein with N-methyltransferase activity of mono- and di-methylation at the level of the lysine residue 36 of histone H3 (H3K36). This epigenetic modification regulates transcription and co-transcriptional processes, both in an activating or inhibiting manner, depending on the surrounding epigenetic environment as well as the position within the gene sequence, thus playing a role as a bifunctional transcriptional regulator. The methyltransferase activity of NSD1 is also preserved in other metazoa since this protein belongs to the phylogenetically well-conserved family of lysine-HMTase NSD, including NSD2 and NSD3. NSD1 is expressed in several tissue districts, including the central nervous system, both fetal and adult one. Haploinsufficiency in the NSD1 gene is found with high frequency in subjects suffering from Sotos Syndrome (SS), whose estimated incidence is 1:14,000 live-births. The clinical picture is characterized by accelerated prenatal and infant growth, accelerated bone growth, macrocephaly, characteristic facial features, intellectual disability and autistic behavioral traits. The thesis project aims to study the effect of the loss of function of NSD1, with particular reference to neuronal and craniofacial development, using as a model the teleosteo Danio rerio (zebrafish). Due to a teleostea-specific genomic duplication event, two orthologs to the human NSD1 gene are recognized in zebrafish: nsd1a and nsd1b, which encode for proteins characterized by a high index of homology with the human NSD1 protein above 80%. In order to create and characterize a model with loss of function for orthologous genes of NSD1 in zebrafish the technique of gene editing CRISPR/Cas9 has been employed to operate targeted, rapid and low-cost mutagenesis of nsd1a and nsd1b, through micro-injection into the zebrafish zygote of the ribonucleoprotein complex composed of guide RNA (crRNA:tracrRNA) and Cas9 endonuclease. Preliminary validation of nsd1b guide RNA was demonstrated by in vitro assay of ribonucleoprotein endonuclease activity, with the future perspective of employ this system in vivo. Regarding the other orthologue nsd1a, three deletion mutant lines have been already created in the hosting laboratory, characterized by lacking of 5, 7 or 11 nucleotides in nsd1a coding sequence (nsd1a Δ5, Δ7 and Δ11). Employing these lines I carried out molecular, morphometric and behavioral studies. In particular, craniofacial craniofacial malformations has been found in heterozygous larvae for nsd1a Δ11 mutation reseambling those observed in patients with Sotos syndrome.

Once the heterozygous mutants were identified, it was possible to evaluate some behavioral aspects through the Open Field test, highlighting the absence of significant differences between heterozygotes and wild types.

In addition, we validated the use of specific antibodies recognizing the different methylation status of H3K36 on zebrafish protein extract, to demonstrate with further experiments the conservation of methylase activity in Nsd1a and Nsd1b protein.

In parallel, a protocol has been developed to modulate the levels of specific mRNA in the early stages of embryonic development of zebrafish, using the technique based on the protein Cas13d, an RNA endonuclease that exterts cutting activity and subsequent degradation of mRNA, recognized by an guide RNA. In particular, both the recombinant protein Cas13d and the mRNA Cas13d synthesized in vitro from a plasmid have been synthesized and purified. Subsequently, the efficiency of the latter was analyzed, evaluating the effect of the micro-injection in zebrafish zygotes, together with two guide RNA directed against the tbxta mRNA, to verify the efficiency of the system. The ultimate goal would be to apply this knock down technique to our genes of interest, such as nsd1a and nsd1b, to characterize the effect of reduced expression of these genes on the embryonic development of zebrafish. The zebrafish model organism demonstrates a great potential as a disease model for SS and can be used for epigenetic modification studies related to the physiological aging process, to the maintenance of genome integrity, but also as a preclinical platform for oncological experiments.