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RAS proteins are small intracellular GTPases that regulate a variety of cellular processes, including proliferation, survival, differentiation, apoptosis, and cell-cell interactions. RAS proteins function by cycling between an active, GTP-bound state (RAS-GTP) and an inactive, GDP-bound state (RAS-GDP). In their active GTP-bound form, RAS proteins can bind and activate multiple effector proteins.

Mutations in genes belonging to the RAS family are commonly found in 20%-30% of all human cancers, making them attractive targets for oncological therapy.

During my thesis internship, I focused on studying the NRAS gene, a member of the RAS family, which is mapped to chromosome 1. Melanoma and multiple myeloma are among the tumors with the highest frequency of NRAS mutations. As an experimental model, the SK-Mel-2 melanoma cell line was used, which harbors the NRAS 182A>G (Q61R) mutation in heterozygosity.

This specific mutation leads to the oncogenic activation of NRAS, resulting in cell proliferation that is independent of growth factors. Consequently, NRAS Q61 mutations are recognized as driver events in tumorigenesis and crucial therapeutic targets. However, the development of NRAS-selective inhibitors has not been successful in recent decades. For this reason, we investigated whether a gene-editing approach based on the CRISPR/Cas9 system could represent an alternative to conventional drugs.

This approach relies on a gene-editing system composed of a guide RNA, complementary to the NRAS sequence, and a Cas9 protein that acts as a "molecular scissor" to cut the target gene. In this study, two mutated variants of Cas9, Cas9 EQR and Cas9 VQR, were utilized. These variants specifically recognize the PAM sequences "NGAG" and "NGA," which are exclusively generated in the mutant allele but not in the wild-type allele.

As a positive control for NRAS gene silencing, previously selected siRNAs were used. These molecules efficiently inhibit the mutant NRAS variant by binding to its mutated mRNA and inducing degradation via the RISC complex.

To assess successful editing of the mutant NRAS allele, molecular assays such as ASO-PCR, Sanger sequencing, and protein expression analysis via western blot were performed. Additionally, to determine whether NRAS inhibition had a biological effect, cell proliferation was evaluated through growth curve analysis and doubling time measurement.


Le proteine RAS sono piccole GTPasi intracellulari che regolano una serie di processi, come la proliferazione, la sopravvivenza, il differenziamento cellulare, l'apoptosi e le interazioni cellula-cellula. Le proteine RAS funzionano passando da uno stato attivo, legato al GTP (RAS-GTP), a uno stato inattivo, legato al GDP (RAS-GDP). Nella forma attiva legata al GTP, RAS è in grado di legare e attivare le sue molteplici proteine effettrici.
Le mutazioni dei geni membri della famiglia RAS si trovano comunemente nel 20%-30% di tutti i tumori umani, rendendole bersagli interessanti per la terapia oncologica.
Durante l’internato di tesi mi sono dedicata allo studio del gene NRAS, che fa parte della famiglia RAS e mappa sul cromosoma 1. Il melanoma e il mieloma multiplo sono tra i tumori con frequenze più elevate di mutazioni in NRAS. Come modello sperimentale è stata dunque utilizzata la linea cellulare di melanoma SK-Mel-2, che presenta la mutazione NRAS 182A>G (Q61R) in eterozigosi.
La suddetta mutazione determina l’attivazione oncogenica di NRAS, con conseguente proliferazione cellulare indipendente dai fattori di crescita. Pertanto, le mutazioni NRAS Q61 sono note come eventi driver della tumorigenesi e importanti bersagli terapeutici. Tuttavia, lo sviluppo di inibitori NRAS-selettivi non ha avuto successo negli ultimi decenni. Per questo motivo, abbiamo testato se l’approccio basato sull’editing genico tramite sistema CRISPR/Cas9 possa rappresentare un’alternativa ai farmaci convenzionali.
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Tale approccio si basa sull’utilizzo di un sistema per l’editing genetico costituito da un RNA guida, complementare alla sequenza di NRAS, e da una Cas9 che si comporta da “forbice molecolare” tagliando il gene desiderato. Per questo studio sono state utilizzate due varianti mutate di Cas9, la Cas9 EQR e la Cas9 VQR, che riconoscono rispettivamente le sequenze PAM “NGAG” e “NGA” che si generano esclusivamente nell’allele mutato e non nell’allele wild type.
Come controllo positivo del silenziamento genico di NRAS, sono stati utilizzati dei siRNA, precedentemente selezionati, in grado di inibire efficientemente la variante mutata di NRAS. Tali molecole sono capaci di legare l’mRNA mutato di NRAS, inducendone la degradazione tramite il complesso RISC.
Al fine di valutare l’avvenuto editing nell’allele mutato di NRAS, sono stati eseguiti saggi molecolari quali ASO-PCR, sequenziamento di Sanger e analisi dell’espressione proteica tramite western blot. Inoltre, per valutare se l’inibizione di NRAS avesse anche un effetto biologico è stata valutata la proliferazione cellulare tramite curva di crescita e tramite analisi del doubling time.